人可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)ELISA试剂盒应用方法

  产品名称:人可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)ELISA试剂盒

  英文名称:Human(sICAM-1)ELISA Kit

  检测方法双抗夹心法/酶联免疫方法

  规格96T/48T

  反应时间3.5h

  反应性Human

  样本体积100μL

  检测范围：12.5 ng/mL–400 ng/mL。

  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

  重复性：板内变异系数小于10%，板间变异系数小于15%。

  有效期：6个月

  保存条件：2-8℃

  可检测多种生物样品，包括：血清、血浆、体液如尿液、细胞培养上清液和细胞/组织裂解液等。

  本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)的含量。

  【实验原理】

  本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗人sICAM-1抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人sICAM-1会与包被抗体结合。依次加入生物素化的抗人sICAM-1抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。抗人sICAM-1抗体与结合在包被抗体上的人sICAM-1结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，sICAM-1浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中sICAM-1的浓度。

  试剂盒的组成

  96/48微孔板(1块,已包被抗人可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)ELISA试剂盒单抗)、样品稀释液(1瓶)、抗体工作液(1瓶)、酶标抗体工作液(1瓶)、底物稀释液(1瓶)、终止液(1瓶)、洗涤液(20×,1瓶)、标准品(2000 pg/ml,2管,冻干粉)、OPD片(3片)、坐标纸(1张)。

  实验准备工作

  1、试剂配制:洗涤液按1:20三蒸水稀释;标准品在用前每管加入200?l蒸馏水溶解即可(具体见说明书);底物工作液应在显色前5-10 min将OPD片放入底物稀释液中溶解,每片加5 ml液。

  2、标本收集:采集血清或体液尽早检测,2~8℃保存一天需长时间须冷冻(-20℃)保存,避免反复冻融;组织(胎肝、胎脑等)实验前一天组织匀浆,用90%体积RIPA裂解液(PH 8.0,50 mM Tris HCl、1%NP-40、,0.25%sodium deoxycholate、150 mM NaCl、1 mM EDTA)和10%体积的10 mM PMSF进行组织匀浆(10%),冰上裂解30 min,12000×20min后取上清,4℃待用。

  3、器材准备:酶标仪、37℃恒温烤箱、滤纸、托盘、量筒、烧杯、各种规格的移液器、离心管、管架和废液缸等。三蒸水自备。

  操作步骤

  1、设立标准孔8孔(根据样品蛋白浓度可调整为6孔),每孔中先各加入样品稀释液100 ul,孔再加标准品100 ul,混匀后用移液器吸出100 ul,移至第二孔,如此反复作对倍稀释至第7孔,后,从第7孔中吸出100 ul弃去,使之体积均为100 ul。第8孔为空白对照。

  2、加样:待测样品孔中每孔各加入待测样品100ul。

  3、将反应板置于37℃×120 min。

  4、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上扣干。

  5、每孔中加入抗体工作液50ul。

  6、将反应板充分混匀后置37℃×60 min。

  7、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。

  8、每孔加酶标抗体工作液100ul。

  9、将反应板置于37℃120 min。

  10、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。

  11、每孔中加入底物工作液100ul,置于37℃暗处反应5~10 min。

  12、每孔中加入50ul终止液混匀。

  13、用酶标仪在492 nm处测吸光值。

  人可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)ELISA试剂盒计算结果与判断

  1、以标准品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 pg/ml之OD值在半对数纸上作图,画出标准曲线。

  2、所有OD值都应减去空白管值后再计算。

  根据样品OD值在该标准曲线图上查出或根据标准曲线公式换算出相应样品中TNF-a含量。

  注意事项

  1、以上标准孔及待查样品均建议做复孔,每次测定均要做标准孔。

  2、本试剂盒宜置-20℃冷藏保存。

  3、本人ELISA试剂盒取出的试剂在室温(20~25℃)环境下使用,溶液应轻轻摇匀后使用。

  4、本试剂盒含2M硫酸,不要将它与含叠氮化钠的废物混在一起。

  5、板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥。

  6、避免交叉污染。如洗涤时向样品待测蛋白含量可能高的一侧倾倒。

  7、提前24 h打开烤箱预热。

  8、底物工作液应在显色前5~10 min配制。若配制时间过长,会变质。

  9、甩尽孔内液体,每孔加350 ul左右洗涤液,静止30 s后甩尽。尤其加抗体工作液或底物时尽量弄干孔内液体。且孵育过程中要盖住各反应孔,防止液体恢复。

  10、尽量防止样品待测蛋白浓度过高而出现酶标仪显示out。当酶标仪测定值出现许多out时,可通过稀释一定倍数后用可见光分光计测定,所有孔均同时测定.