可保种型蓝白T载体说明书
产品编号：BTN60803
规格：50ng
产品及特点：
本产品(曾用名:一站式蓝白T 载体)是环状的可以制备克必隆蓝白T 载体的质粒DNA。T 载体是克隆PCR 扩增产物的必不可少的工具，但是由于市场上的各种T 载体质量参差不齐，用户很难购买到满意的产品；同时购买的T载体为线性DNA，不能保种，必须反复购买，累计成本很高。为解决这一问题，百奥莱博特推出可保种型T 载体，用户只需要购买Xcm I 内切酶就可以自己制备高质量的T载体，随用随配，十分方便。
1. 一次购买，终身拥有。本产品提供制备T 载体用的环形质粒DNA，可以象其他质粒一样保种并长期保存。
2. 随用随配，十分方便。用户只需要提供Xcm I 限制性内切酶和基本分子生物学实验条件，就可以自己制备T 载体。整个过程只需要两天。
3. T 载体含T 率为。本方法不是使用传统的加尾法，而是使用Xcm I 酶切法。质粒的多克隆位点上预先插入了一段长为1.3 Kb 的Xcm I DNA 片段,经Xcm I 酶切后回收得到的质粒DNA（T 载体）两端自然全部带有T 突出，比例远远高于用Taq DNA 聚合酶加尾法和TdT 加尾法得到的T 载体。
4. 方便各种下游操作。用本产品得到的蓝白T 载体插入位点两侧有多种常见的酶切位点，便于后续克隆； Xcm I 位点在Alpha 互补区，可以使用蓝白斑筛选重组子；两边还有T7 和SP6 RNA 聚合酶启动子，便于制备RNA 探针。
格及成分：
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成分 |
规格 |
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蓝白T载体(环状) |
50ng |
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说明书 |
1份 |
保存条件：
低温运输，-20℃保存，有效期两年。
自备试剂：
连接反应试剂。
使用方法：
一. 细菌的转化
1. 将100 μL感受态细胞于冰上解冻。注意：zui好使用end A1菌种（如DH1、DH5、DH5a、JM109、XL1-Blue等。常用宿主细菌的基因型可以参考《分子克隆手册》等参考书）。因为这类细菌所含DNase少，制备T载体后，残留的DNase对的T末端的破坏机会更小。
2. 取5-10 μL本产品加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。
3. 将管放入预加温到42℃的水浴中，热休克90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2分钟。
4. 每管中加900 μL LB培养基，37℃振荡培养1小时。
5. 取100 μL培养液涂布到含Amp的LB琼脂平板表面。
6. 将平板置于室温直至液体被吸收。
7. 倒置平皿，于37℃培养，12～16小时后可出现菌落。
二. 细菌的鉴定
1. 挑取单个菌落进行过夜细菌培养。
2. 按常规的方法进行质粒小量制备。
3. 用Xcm I内切酶按下面条件酶切提取的质粒DNA，如果大规模酶切，需要按比例增加各成分用量:
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成分 |
使用量 |
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Xcm I Buffer,10× |
5μl |
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质粒DNA |
<或= 2 ug |
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Xcm I |
1μl |
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超纯水 |
加到50μl |
37℃保温一小时, 65℃保温20分钟使酶失活。
4. 电泳，本产品被Xcm I酶切后将产生3 Kb和1.3 Kb的两段DNA。
5. 如果Xcm I酶切图谱正确，则按常规的方法进行细菌的保种。
三. T载体的制备
1. 参考《分子克隆手册》等参考书培养细菌和提取质粒DNA。注意：一定要去尽可能去除残留的RNA和蛋白质（含残留DNase）的污染。
2. 用Xcm I酶切质粒。注意：酶切时间zui好不要超过一小时，避免残留的DNase对T末端的破坏。
3. 电泳后切下含3Kb DNA（既蓝白T载体）的胶段。注意：千万不要用UV照射将要回收的片段，因为UV会使DNA交连，使DNA失去转化细菌的能力。如果酶切的DNA量大，可以使用百奥莱博绿如蓝核酸染料,可以直接在可见光和黑背景下切胶。如果别无选择，zui好在长波（360nm）紫外灯下快速切胶，尽可能切掉多余的凝胶。为避免DNA交连，可以使用百奥莱博的DNA防护剂UV Erasol（BTN60601）
4. 用常规DNA回收方法进行胶回收。
5. 测定T载体DNA的浓度后，将T载体DNA保存在-20℃备用或直接使用。
四. 连接反应
1. 短暂离心装有T载体的离心管。
2. 在两个离心管中加入下列成分：
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成分 |
样品管 |
阴性对照管 |
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T4 Ligase Buffer，10× |
1μl |
1μl |
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蓝白T载体 |
20-50ng |
20-50ng |
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PCR 纯化产物 |
50-500ng |
不加 |
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T4 Ligase |
3-5U |
3-5U |
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补水到 |
10μl |
10μl |
注意: PCR纯化产物与蓝白T载体的摩尔比zui好为3:1-10:1。
3. 用移液器吹打连接反应使之混匀后，16℃孵育12小时(或按T4 Ligase供货商提供的操作说明书进行连接)。
五. 细菌转化和鉴定
1. 取5 μL连接产物进行转化，具体步骤见本手册一，zui好使用含X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板以便进行蓝白筛选。
2. 按经典的质粒提取+酶切或测序鉴定，可以选用的、在插入位点两侧都有酶切位点的酶有BstZ I、EcoR I和Not I。可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。按菌落PCR方法筛选，可选用百奥莱博的菌落PCR试剂盒（BTN50901）进行快速筛选，需要T7和SP6 RNA聚合酶启动子引物。
