土壤DNA提取试剂盒说明书
产品编号：BTN60701
规格：50T
产品及特点：
由于土壤中有机质含量丰富,尤其是其中的腐殖酸对PCR等后续反应有大的抑制作用,所以从土壤微生物提取高纯度的DNA一直是十分棘手的问题。本产品是百奥莱博精心优化的专门用于从各种土壤样品和河海沉积物中提取高质量的DNA的试剂。
1. 去污染效guo好，OD260/280一般都在1.8以上, OD260/340一般都在3.0以上(表示腐殖酸少),得到的DNA样品原液或稀释液可以直接用于PCR等后续反应。
2. 产量高，每克土壤一般可以提取到5 ug 左右DNA，片段长度在30 Kb左右。
3. 操作过程简单快速，只需要30分钟。
4. 扩容性好，既可以在1.5 mL离心管中微量提取，也可以在50 mL离心管中进行大规模制备。
5. 试剂无害, 环保。
规格及成分：
|
成分 |
规格 |
|
溶液A |
25ml |
|
溶液B |
25ml |
|
说明书 |
1份 |
保存条件：
常温运输及保存，有效期一年。
自备试剂：
氯fang、无水乙醇、75%乙醇。
使用方法：
1. 65℃预热溶液A，待其沉淀溶化后，充分混匀，取0.5 mL加入到1.5 mL塑料离心管中并放置于65℃待用。
2. 称取0.1-0.3 g的土壤，加入到含预热溶液A的离心管中，震荡器上剧烈震荡5-10分钟。如果是扩量操作，可以使用更多土壤和较大离心管。也可以将同一种土壤在较大离心管中震荡处理，然后再分到1.5 mL离心管中。注意:不论使用大的还是小的离心管，一定要让管底的土壤震荡起来。
3. 将离心管置于65℃水浴中保温至少5分钟。
4. 13000-15000 g室温离心3分钟，将上清转移到一新离心管中(上清液一般呈淡黄色或深棕色，具体取决于腐殖酸的含量，上清的体积一般为300-400μL)。
5. 在上清液中加入等体积的溶液B，上下颠倒30秒充分混匀，溶液将呈白色或淡黄色混浊状。
6. 将离心管冰浴至少5分钟。
7. 13000-15000 g室温离心3分钟，转移上清到新的1.5 mL离心管中，上清液颜色将比第4步得到的上清的颜色稍淡，体积在0.7 mL左右。
1. 65℃预热溶液A，待其沉淀溶化后，充分混匀，取0.5 mL加入到1.5 mL塑料离心管中并放置于65℃待用。
2. 称取0.1-0.3 g的土壤，加入到含预热溶液A的离心管中，震荡器上剧烈震荡5-10分钟。如果是扩量操作，可以使用更多土壤和较大离心管。也可以将同一种土壤在较大离心管中震荡处理，然后再分到1.5 mL离心管中。注意:不论使用大的还是小的离心管，一定要让管底的土壤震荡起来。
3. 将离心管置于65℃水浴中保温至少5分钟。
4. 13000-15000 g室温离心3分钟，将上清转移到一新离心管中(上清液一般呈淡黄色或深棕色，具体取决于腐殖酸的含量，上清的体积一般为300-400 μL)。
5. 在上清液中加入等体积的溶液B，上下颠倒30秒充分混匀，溶液将呈白色或淡黄色混浊状。
6. 将离心管冰浴至少5分钟。
7. 13000-15000 g室温离心3分钟，转移上清到新的1.5 mL离心管中，上清液颜色将比第4步得到的上清的颜色稍淡，体积在0.7 mL左右。
8. 加入0.2 mL的氯fang(自备)，震荡器上充分振荡30秒混匀。注意:一定要让管底的溶液震荡起来。
9. 13000-15000 g室温离心3分钟，小心转移上清到新离心管中。说明：离心后两相交界面将有白色膜状物，其中有机相部分颜色较深，一般呈淡棕色。上清的颜色取决于土壤中腐殖酸的含量。
10. 重复第8步和第9步一次。zui后将上清转移到新的1.5 mL离心管时，不要超过0.5 mL，否则没有空间加两倍体积的乙醇。如果有多余的可以弃之不用。
11. 加入2倍体积的乙醇(自备)，上下颠倒30秒混匀，15000 g离心5分钟,弃上清，管底将有微小DNA沉淀，有时候呈棕色。注意：不要用异丙醇代替乙醇，否则腐殖酸更容易于DNA共沉淀。
12. 加入1mL 75%乙醇，震荡，13000-15000 g室温离心3分钟，弃上清。
13. 重复上步清洗一次。注意：75%乙醇洗两次有助于去除部分腐殖酸。
14. 短暂离心，吸弃残留的75%乙醇（约50μL），室温晾干。注意：一定要去除残留的75%乙醇，否则会影响后续反应和电泳上样（样品会飘走）。
15. 加入30 μL TE缓冲液溶解沉淀。注意：不知道样品土壤DNA产率前zui好不要加过多TE，如果DNA浓度高，可以再加TE稀释。
16. DNA即可用于电泳、酶切和PCR等反应。 电泳时zui好采取电泳后染色，因为实验发现，残留腐殖酸会吸附走大量的EB，使在腐殖酸后面的DNA不能染色。
备注：
有用户反映提淤泥的DNA时，将步骤2中的剧烈震荡5-10分钟改成混匀3分钟，步骤3中的65℃水浴中保温时间延长到10分钟，再重复8步，9步一次，可以得到完整清晰明亮DNA条带。
疑难解答：
Q: 如何判断提取的ＤＮＡ没有腐植酸污染？
A：方法一是目测法，即看得到的溶液是否无色。如果呈淡棕黑色或淡黄色，说明可能是少量残留的未除尽的腐植酸。方法二是检测zui大光吸收。注意：有腐植酸污染并不表示DNA不能使用，有的腐殖酸并不抑制PCR扩增。
Q: 腐殖酸的zui大吸收波长是多少？
A：腐植酸（humic acid）是一大类呈棕黑色或黑色的物质,其结构千差万别，土壤中腐殖酸的组成和特点随土壤不同而不同，所以其zui大吸收波长也各不相同，有的土壤的腐殖酸在260 nm有zui大吸收（见Appl.Environ. Microbiol., 63：4993, 1997），有的则在340 nm。所以用特定的波长测定OD值时波长的选定要根据土壤而决定。Sigma, Fluke等公司出售的腐植酸产品成分一般比较简单，其zui大吸收波长不能推广到成分更为复杂的土壤腐殖酸样品。
Q:本产品是否彻底去除土壤DNA中的所有腐植酸?
A: 腐植酸（humic acid）是动、植物的残骸经过微生物的分解、转化和成千上万年的复杂化学反应而产生的特性各异的一大类物质，其含量和种类随土壤不同而不同。本产品可以从大部分土壤样品中提取到无腐殖酸污染的DNA。但对于腐殖酸含量特别高的土壤样品（如泥碳样品，含70%腐殖酸），可能还需要使用柱式腐殖酸清除剂（BTN60801）以便清除DNA样品中残留的腐殖酸。
Q: 是否腐植酸都会抑制后续的DNA反应？
A：否，因为腐植酸是一大类物质的统称，他们的结构和特性各不相同，所以是否对后续反应有影响zui好通过实验来验证。如果用提取的DNA溶液原液进行反应而反应没发生，而对照样品（已知的不含污染的DNA）能够发生，说明可能抑制作用。
Q：如果样品含有抑制后续反应的腐植酸，如何去除？
A：如果提取的DNA原液不能扩增，可以将样品稀释10倍和100倍再进行PCR，抑制作用一般可以解除。如果仍然抑制，可以使用我公司的PCR Inhibitor Erasol（BTN60804）。如果仍然不能解除，则可以通过柱式腐殖酸清除剂（BTN60801）或先电泳，再用片段胶回收试剂Magic Gel DNABACK（BTN60706）纯化土壤DNA，去除残留抑制剂。其中后两方法zui有效，得到的原液一般可以直接扩增。
Q：在用土壤DNA进行细菌专一性PCR时，为何没加DNA模版的阴性对照有扩增产物出现？
A：这是由于使用的Taq DNA聚合酶一般从E.coli表达菌株中提取，提取过程中污染了E.coli的基因组DNA，而使用的广谱细菌专一性引物可以识别所有细菌DNA基因组DNA模版，所以会产生扩增。建议使用高质量的Taq DNA聚合酶。
