BTN60603 即用型蓝白T载体A型(T7-SP6,有MCS)说明书

即用型蓝白T载体A型(T7-SP6,有MCS)说明书

产品编号：BTN60603

规格：20T

产品及特点：

本产品是用Xcm I酶切环状的可保种型蓝白T载体(BTN60803)去掉一段1.3Kb的插入片段后得到的线性DNA片段(载体部分)，其两个末端的5’都有一个突出的T，可以用于快速克隆具有加尾活性的耐热酶(如Taq DNA聚合酶)扩增得到的PCR片段。

1. 由于是通过Xcm I酶切制备，所以载体两端的带T率为，远高于用Taq DNA聚合酶和TdT末端转移酶在平末端载体加尾得到的T载体。

2. 克隆的阳性率一般在90%以上, 缩短了筛选过程。

3. 插入位点两侧有对称的常见酶切位点（如EcoR I），便于对克隆的PCR片段进行近一步的分析。

4. 克隆位点两侧分别有T7和T3 RNA聚合酶启动子, 便于用克隆的PCR片段制备RNA探针。

5. 可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。

6. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α-肽编码区内，可以进行蓝白斑筛选。

7. 含有丝状噬菌体f1 复制起始子，可以制备单链DNA。

格及成分：

保存条件：

低温运输，-20℃保存，有效期两年。

自备试剂：

连接反应试剂，超纯水。

使用方法：

一. PCR产物的纯化和定量

1. 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离。zui好不要使用TBE缓冲液，因为它会影响DNA的胶回收效率。

2. 在长波(360nm)紫外灯下快速切胶，尽可能切掉多余的凝胶。为避免嘧啶二聚体的形成，可以使用百奥莱博的DNA防护剂UV Erasol（BTN60601）。

3. 用百奥莱博的柱式DNABACK（BTN60202）纯化回收PCR片段。溶解PCR片段的超纯水体积越小越便于后续操作。

4. 将回收的片段与浓度已知的DNA Marker在含EB（BTN3180）或绿如蓝染料（BTN70303）的琼脂糖凝胶中电泳，通过比较DNA条带的荧光强度

而估测PCR纯化产物的浓度。注意：一般不推荐使用测OD260的方法，因为回收的DNA很珍贵，该方法需要比较多的DNA。

5. 如果所得的DNA片段浓度较低，可以使用本公司核酸浓缩剂（BTN110801）将其浓缩到需要的浓度。

6. 如果PCR片段为平末端，则需要用加A试剂盒处理，否则不能用于与T载体的连接反应。

二. 连接反应

1. 短暂离心装有T载体的离心管。

2. 在两个离心管中加入下列成分：

注: PCR纯化产物与蓝白T载体的摩尔比zui好为3-10，可以按下面的公式计算出连接反应中需要的PCR 纯化产物的ng数:

假如插入片段和载体的连接比例设定为3，连接反应中加入蓝白T载体(长度为3 Kb)的量为40ng，则需要长度为0.5 Kb 的PCR 纯化产物的量是:

3. 用移液器吹打连接反应使之混匀后，16℃孵育12小时(或按T4 Ligase供货商提供的说明书进行连接)。

三. 细菌转化

1. 将100 μL感受态细胞于冰上解冻。注意：zui好使用转化效率在1×10⁸cfu/μg DNA以上的感受态细胞进行转化，因为采用单碱基突出端进行连接不是很有效。

2. 取5 μL连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。

3. 将管放入预加温到42℃的水浴中，热休克90秒。快速将管转移到冰浴中。