BTN60305 真菌RNA提取试剂盒说明书

真菌RNA提取试剂盒说明书

产品编号：BTN60305

规格：50T/250T

产品及特点：

本产品专门用于从常见的各种真菌和革兰氏阳性细菌中快速提取总RNA，提取过的真菌包括Candida albican，Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomyces pombe 和Pichia pastoris、Aspergillus flavus等。

1. RNA 纯度高，OD260/280 一般都在2.0 左右，可直接用于RT-PCR、Northern 杂交、microarray hybridization、cDNA 合成等。

2. RNA 产量高，一般在20-70 μg/mL 酵母培养物(约2.0×10⁷个细胞)

3. 操作简单，整个过程只需要约30 分钟。

4. zui大处理量为10 mL 酵母。

5. 固体培养基上的真菌菌落也可以直接用于提取。

规格及成分：

保存条件：

常温运输，4℃保存，有效期一年。

自备试剂：

氯fang、75%乙醇、RNase-free 水。

使用方法：

1. 将 50 mg 左右的干菌丝(或100 mg 左右的鲜菌丝、或适当数量的真菌菌落或革兰氏阳性细菌)转移到1.5 mL 塑料离心管中。如果是液体真菌培养物，则直接将 1-10 mL 液体真菌在1.5 mL 塑料离心管中12000-15000 g 离心 1 分钟，并弃尽液体培养基（可以分多次离心）。

2. 加入 0.4 mL 溶液A 并充分吹打混匀。如果A 溶液存放时产生沉淀，请置于65℃融化，用前充分摇晃均匀。

3. 加入 0.4 mL 溶液B，剧烈振荡30 秒。

4. 65℃保温5 分钟。

5. 室温 12000-15000 g 离心3-5 分钟，转移上清到一干净的1.5 mL 塑料离心管中.

6. 再加入0.1 mL 溶液B 和0.1 mL 自备氯fang，振荡混匀30 秒。

7. 室温 12000-15000 g 离心3-5 分钟，转移上清到一干净的1.5 mL 塑料离心管中。

8. 加入两倍体积（约0.8-1mL）的溶液C，充分混匀。

9. 室温 12000-15000 g 离心离心3-10 分钟，RNA 将在管底形成沉淀，小心弃上清。

10. 加自备的75%乙醇，振荡器上振荡混均30秒。

11. 室温 12000-15000 g 离心1分钟。

12. 小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。

13. 重复 75%乙醇洗涤步骤一次。

14. 短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液（约50μL）。

15. 短暂放1-2 分钟后加入100 μL 左右的RNA-free 水使RNA 沉淀溶解，可以立即使用或存放于-80℃长期保存。

16. RNA 完整性的电泳检测：

如果需要做Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是简单检测， 可以使用TAE 或百奥莱博的SuperBuffer-2 DNA/RNA 两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液（BioTechniques，9:558，1990）。普通DNA 上样液不含变性剂，也没经过去RNase 处理，所以zui好不要使用。尤其需要注意的是不要使用TBE 进行RNA 电泳，因为TBE 所含硼酸是研究多糖的经典方法----硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与RNA核糖中的羟基发生络合反应，形成RNA 分子内或RNA 分子间的络合复合物，使同样长度的RNA 具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有大的RNA 络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组DNA 污染）。RNA 分子内或RNA 分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸与RNA 的数量比例有关，而RNA 样品中污染的其他多糖也会参与此反应，使硼酸对RNA 电泳的影响更复杂，所以TBE 对RNA 电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，zui好是避免使用。

17. RNA 产量产率测定：

将5-10 μL RNA 溶于TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA 浓度（1 OD260 的RNA=40μg/mL），进而计算出RNA 的产量（浓度X 体积)和产率(RNA 产量/细菌用量)。注意不要将RNA 稀释在DEPC 水中检测OD260 和OD280，否则光吸收比在TE 中测得的低10%-15%。

18. RNA 纯度测定：

无污染的总RNA 的OD260/OD280 一般在1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，OD260/OD230 一般在2.0-2.3 之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响RT-PCR 等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯fang抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分别用我司基因的DNA Erasol 和PS Erasol 去除。

疑难解答：

Q：为何从酵母中提取的总RNA 有3 条小带？

A：它们分别是70 bp 左右的tRNA, 120 bp 左右的5 S RNA, 160 bp 左右的5.8 S RNA。

Q：上样孔里的红色荧光物一定是污染的基因组DNA 吗？

A：不是。用TAE 或TBE 电泳液和非变性胶电泳RNA 时容易产生此现象，百奥莱博初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA 通过碱基互补或通过硼酸络合（如果使用TBE 作电泳液的话）形成的复合物，加RNase 处理后，这些红色荧光物一般会消失。为避免此现象，建议zui好使用甲醛变性胶电泳。如果需要使用非变性胶，也必须在上样前使RNA/变性。使用百奥莱博优化的上样变性/染色三用溶液RNAON可以使RNA

在非变性胶上电泳时也有较好分辨率。使用非变性胶时，可以使用TAE或超快电泳液SuperBuffer-2，zui好不要使用TBE 缓冲液，因为TBE 中的硼酸能与RNA 的多羟基形成复合物，RNA 很难形成锐利的条带。

Q：如何确认和去处除污染的基因组DNA？

A：如果怀疑有DNA 污染，可以用RNase 处理RNA 样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组DNA 污染。进一步确认可以使用PCR 扩增法。去除污染的DNA 可以使用非酶的DNA 去除剂DNA Erasol 或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase 一般都有残留的RNase 污染，所以必须严格按照厂家提供的使用手册进行操作。