一管式病毒RNA提取试剂盒说明书
产品编号：BTN3073
规格：50T/200T
产品及特点：
本产品是专用于血清(血浆)等液体样品中提取病毒RNA的纯化试剂。本产品回收率高,尤其适合于整合到临床RT-PCR检测试剂盒中。且能用于提取其他液体样品和微量样品。
1. 回收率达到90%以上，高于大部分基于离心柱的提取方法。
2. 灵敏度高，RT-PCR检测到的zui终灵敏度可以达到50-100拷贝/mL(对HIV和HCV)。
3. 一管式操作，不使用离心柱，整个操作过程均在室温下完成。
4. 环保，不需要使用苯酚和氯fang等有毒的有机溶液。
5. 可放量，如果加上病毒离心富集步骤，每管zui多可以处理样品1.5 mL。
规格及成分：
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成分 |
50T |
200T |
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溶液A |
30ml |
120ml |
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说明书 |
1份 |
1份 |
保存条件：
常温运输，4℃保存，有效期一年。
自备试剂：
异丙醇，70%乙醇。
使用方法：
一：准备工作
1. 血浆的抗凝剂必须是EDTA或ACD，不能是肝素。使用ACD时由于所加入ACD会增加体积，样品会被稀释，得到的病毒滴度会比使用EDTA低15%左右。
2. 用于制备血浆的全血在2-25℃放置的时间不能超过6小时，在此时间内，可以室温800-1600g离心20分钟，上清即为血浆。
3. 血浆可以在2-8℃或更低温度下运输，可以在室温放置一天，2-8℃放置5天，-20℃以下长期保存。
4. 血浆zui好按0.6mL/管的量分装保存，以避免反复冻融。
5. 实验前所有试都必须放置在室温。
6. 实验当天新鲜配制70%的乙醇。
二：病毒提取操作
1. 标记1.5-2 mL螺旋盖塑料离心管(如Sarstedt CAT#:782.694.006)，为避免污染，建议不要使用压盖式塑料离心管。注意设置阳性和阴性对照。
2. 每管（包括正负对照管）中加入0.6 mL病毒RNAOUT溶液（需提前融化）。
3. 快速震荡样品几秒，再短暂离心，取0.2 mL液体样品加入到已经装有0.6 mL病毒RNAOUT溶液的管中。如果病毒需要富集，可以将1.5 mL液体样品在4℃ 24,000 g冷冻离心60分钟, 移弃1.3 mL上清后在取用样品。
4. 在正负对照样品管中分别加正负对照样品。
5. 室温放置10分钟。此间可以在每个管上做个标记，以在下步区别向心面和离心面。
6. 振荡数秒后加入0.7 mL室温异丙醇，旋紧盖后振荡30秒混匀，把离心管的向心面对向转头的中央，13,000-15,000 g室温离心至少15分钟。
7. 小心移弃上清，注意不要触及管底和管壁离心面的RNA沉淀（此时可能看不见）。
8. 加入1.0 mL 室温70%乙醇, 振荡数秒后 15,000 g室温离心5分钟。注意：在离心机中放置离心管时将其向心面对向转头的中央。
9. 小心移弃上清，注意不要触及管底和管壁离心面的RNA沉淀（此时呈膜状沉淀）。
10. 再短暂离心数秒, 用移液器移弃残留液体（70%乙醇），否则它会影响后续反应。
11. 加入200 μl RNase-free水或百奥莱博的1×液相RNase Erasol(能灭活残留的RNase, 而RNase-free水无此功能)，用移液枪仔细吹打离心管管底和管壁离心面的膜状RNA沉淀，溶液将呈混浊状,含少量不溶物。由于不溶沉淀物中含有RNA，所以不要离心后取上清使用，必须取混合液使用，哪怕很浑浊。
12. 直接取适量用于RT-PCR，如果溶于200 μL水,同时样品使用量不超过RT-PCR体系的1/2，不溶物一般不会影响RT-PCR。剩余样品可以室温放置2小时，也可保存于-80℃保存一个月。
疑难解答：
Q：提取液体样品/病毒核酸(RNA或DNA)为何很难？
A：原因一是量少。病毒颗粒中的RNA或DNA是作为遗传物质保存，每个病毒zui多只携带几个拷贝(而一个细胞中有上万个RNA分子)，同时其长度也十分有限(是细胞基因组的万分之一以下)，样品中病毒数往往也不是很多，使得样品中核酸的dui量几乎是微乎其微，十分容易丢失。另外，由于得到的核酸量少，不能使用电泳和测OD检测，只能通过PCR或RT-PCR检测，而病毒RNA往往具有稳定的二级结构，进一步增加了鉴定的难度（即不知道是RNA提取的问题还是RT-PCR的问题）。
Q：如何判断是病毒RNA没提取出来还是提取出来了但没有RT-PCR成功？
A：在RT-PCR反应中加阳性和阴性对照。
