质粒小量抽提试剂盒(Plasmid Mini Preparation Kit, Plasmid Miniprep Kit)使用说明书

     质粒小量抽提试剂盒(Plasmid Mini Preparation Kit, Plasmid Miniprep Kit)是一种用于从大肠杆菌中进行小量质粒快速抽提的离心柱式试剂盒。
      本试剂盒适用于常用的EndA^-菌株DH5α、JM109和XL-1 blue等。对于EndA⁺菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101
等，可以顺利完成质粒抽提，但从EndA⁺菌株中抽提获得的质粒会有轻微的核酸酶污染，如果在内切酶缓冲液中37℃孵育1小时会导致质粒全部降解。从EndA⁺菌株中抽提质粒时推荐使用的D0007S/D0007M 质粒小量抽提试剂盒(通用型)、D0020 质粒中量抽提试剂盒(通用型)和D0028 质粒大量抽提试剂盒(通用型)。
      野生型大肠杆菌中表达Endonuclease I，能切割并降解双链DNA。编码Endonuclease I的基因是endA，如果endA突变失活，其基因型会被标注为endA1，相应的突变菌株被称为EndA^-菌株，而野生型菌株则被称为EndA⁺菌株。常见的EndA^-和EndA⁺菌株参见附表1。从EndA⁺菌株中抽提的质粒，微量核酸酶和质粒结合而容易被共纯化，导致容易降解。
      本试剂盒采用了一种的离子交换柱。在特定条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。无需酚氯fang抽提，无需酒精沉淀，12个样品只需不足30分钟即可完成。
      每个质粒纯化柱可以结合的质粒量的上限约为20微克。每个纯化柱可用于抽提1-5毫升用LB培养过夜的大肠杆菌。抽提所得质粒的OD260和OD280比值一般在1.80左右。抽提获得的质粒量会受质粒拷贝数等因素影响。抽提获得的质粒DNA的OD260和OD280比值也会因菌种不同等原因而略有波动。
      本试剂盒抽提所得到的质粒可直接用于转染细胞，DNA测序，PCR，基于PCR的突变，体外转录，转化细菌，内切酶消化等。
包装清单：

保存条件：
      室温保存，一年有效。
注意事项：
      一次使用前把试剂盒提供的RNase A全部加到溶液I (悬浮液)中，混匀，并在瓶上做好标记。加入RNase A后4℃存放。
      一次使用前在每瓶溶液IV (洗涤液)中加入54ml无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
      温度较低时，溶液II和溶液III可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，37℃水浴加热溶解，混匀后使用。溶液II请勿过分剧烈混匀，否则会产生大量气泡。
      溶液II使用完后，一定要盖紧瓶盖，防止被空气中二氧化碳酸化。
      溶液II有强碱性，溶液II、溶液III和溶液IV对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。
      本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
      废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。
      本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
      为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. 取过夜菌1.5毫升，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升过夜菌沉淀。
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约1.5毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量一般不能超过5毫升，对于低拷贝质粒所用菌量一般不能超过10毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。
2. 每管加入250微升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。
确认溶液I中已经添加了RNase A。zui高速度vortex 5-10秒或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开或用手指把沉淀弹开。
3. 每管加入250微升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致zui终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，再室温放置2-3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。
4. 每管加入350微升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。
切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致zui终所得质粒的质量下降。
5. zui高速(13,000rpm左右)室温离心10分钟。
离心后会产生白色沉淀。离心时准备好下一步需使用的质粒纯化柱，废液收集管，并在纯化柱上做好标记。
6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。zui高速离心30-60秒，倒弃收集管内液体。
质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。
7. 在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV，zui高速离心30-60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体。
加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。
8. 再zui高速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。
9. 将质粒纯化柱置于洁净1.5毫升离心管上，加入50微升溶液V至管内柱面上，放置1分钟。
溶液V需要直接加至管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果不慎将溶液V沾在管壁上，一定要震动离心管，使液体滑落到管底，以便被纯化柱吸收。也可以用重蒸水或Milli-Q级纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。如想得到较高浓度的质粒，可以加入35微升溶液V洗脱。
10. zui高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。
通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高浓度的质粒，可以采用常规的乙醇沉淀方法浓缩质粒。
附表1. EndA^- and EndA⁺ strains of E. coli.

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