志贺氏菌荧光 PCR 检测试剂盒说明书

志贺氏菌荧光 PCR 检测试剂盒说明书
1、 试剂盒简介
货号：HB-1131-1
志贺氏菌属(Shigella)即通称的痢疾杆菌，为革兰氏阴性菌。志贺氏菌传染源主要为病人和带菌
者,通过污染了痢疾杆菌的食物、饮水等经口感染，是人类细菌性痢疾为常见的病原菌。
为了适应志贺氏菌快速检测和疫病研究的需要，本公司参考 2007 年质量监督检验检疫总局
发布的中华人民共和国出入境检验检疫行业标准（SN/T 1870-2007）《食品中致病菌检测方法-实时
PCR 法》中规定的引物和探针序列，经多次实验及系统优化，开发生产了本试剂盒。应用本试剂盒
进行检测具有快速、灵敏、特异、准确、安全操作简单、应用广泛和高通量检测等特点及优点。
2、试剂盒组成
试剂盒具体组成如下（50 test/盒）：
组成成分 体积
DEPC 水
志贺氏菌荧光 PCR 反应液
Taq 酶(5 U/uL)
阴性对照
志贺氏菌荧光阳性对照
5 mL×1 管
800 µL×1 管
30 µL×1 管
1 mL×1 管
1 mL×1 管
*保存条件：试剂盒须在-20℃保存。
3、样本采集，存放及运输
3.1 样本采集：无菌称取样品25 g，加入装有225 mL志贺氏菌增菌肉汤的均质杯中，8,000 r/min均质
1 min，42℃厌氧培养16-20 h。取培养好的细菌涂于MAC琼脂平板，37℃培养20~24 h，取长出的
菌落接种于增菌培养基中，37℃培养20~24 h备用。
3.2存放：样本在2 ℃-8 ℃条件下保存应不超过24 h；加入15%-20%甘油可于-70 ℃以下长期保存。
3.3 运输：密封运输，严防泄露污染。
4、检测步骤
4.1 DNA 核酸提取操作方法(在样本处理区进行)：
4.1.1 待检样品增菌处理后，取 n 个 1.5 mL 灭菌 Eppendorf 管，其中 n 为待检样品数、一管阳性对照
和一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记，加入对应样品 1 mL；
4.1.2 于 8,000 r/min 离心 5 min，去上清；
4.1.3 加入灭菌生理盐水洗涤 2 次，后用 1 mL 灭菌生理盐水悬浮；
4.1.4 将样品于置于 100℃干浴或沸水浴 5 min，12,000 r/min 离心 5 min，
4.1.5 吸取上清，即为提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 内进行 PCR 扩增或放置
于-70℃冰箱内保存）。
注：细菌核酸提取可选配细菌 DNA 柱式提取试剂盒（货号：SK-CE-1），效果更好。
4.2 荧光 PCR 检测
4.2.1 扩增试剂准备（在反应混合物配制区进行）：
从试剂盒中取出相应的荧光 PCR 反应液、Taq 酶，2,000 g 离心 5 s。每个样品测试反应体系配
制见下表。
试剂 荧光 PCR 反应液 Taq 酶 合计
用量 14.5 μL 0.5 μL 15 μL
4.2.2 加样（样本处理区进行）：
向每个荧光PCR管孔中各分装15 μL的混合液，再分别加入样本DNA模板10μL，盖紧管盖，
500 r/min 离心 30 s。
4.2.3 PCR 检测（在检测区进行）：
循环条件设置：一阶段，95℃/3 min；
第二阶段，95℃/5 sec，60 ℃/40 sec，40个循环，在第二阶段每次循环的退火延伸时
收集FAM荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
5、结果判定
5.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样
品扩增曲线的zui高点为准。
5.2 质控标准
阴性对照无扩增曲线、无 Ct 值或Ct 值≥40。
阳性对照的 Ct 值应<30，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
5.3 结果描述及判定
阴性: 阴性对照无扩增曲线、无 Ct 值或Ct 值≥40，示样品中无志贺氏菌。
阳性: Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，示样品中存在志贺氏菌。
有效原则:40＞Ct>35的样本建议重做。
6、相关技术信息
F：5’-CGCAATACCTCCGGATTCC-3’
R：5’-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3’
PROBE: 5’-FAM-AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-TAMRA-3’