Ca2+ GPCR 分析-钙离子指示探针 Fluo-8, AM
Cat number：KFS172
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For Research Use o
一、产品描述
Fluo-2 早是由 Roger Tsien 博士发明的钙离子指示剂 Fluo 系列之一，Fluo-3 和 Fluo-4 已成熟商品化。然而，Fluo-2 在细胞内比Fluo-4 要更明亮，主要可能是由于大部分细胞对Fluo-2的加载能力要高于Fluo-4。
Fluo-3 成像涉及到钙离子信号通路的多个方面，Fluo-3 经常应用在流式细胞术上，如螯合剂光活化、第二信使、神经递质以及细胞水平的药理筛选。Fluo-3 在这些应用里之所以能大量运用主要是由于其几个重要特性：Fluo-3 可以被氩离子激光器 488nm 激发，并在与 Ca2+结合后，发射荧光很明亮的荧光信号。Fluo-4 是 Fluo-3 以两个氟原子取代氯原子的类似物，这一微小的结构变化使得 Fluo-4探针在 488nm 激发光下的荧光信号得到增强，信号稳定持续，可以应用于共聚焦显微镜、流式细胞仪、微孔板读数仪。
Fluo-2、Fluo-3 和 Fluo-4 在与 Ca2+结合后荧光增强，与紫外激发的探针 fura-2 和 indo-1 不同，不会发生光谱漂移。荧光光密度在与Ca2+结合后，增强至少 100 倍。Fluo-2、Fluo-3，Fluo-4 和 Fluo-8 的光谱特性，见下表.
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Property |
Fluo-2 |
Fluo-3 |
Fluo-4 |
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Kd (Ca2+) |
390 nm |
325 nm |
345 nm |
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Excitation |
490 nm |
506 nm |
494 nm |
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Emission |
515 nm |
526 nm |
516 nm |
二、产品包装
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组份 |
KFS172 |
储存条件 |
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Fluo-8, AM |
1 mg |
-20℃，避光 |
三、理化性质
Excitation: 488 nm
Emission: 515 nm
Kd: 390 nM
溶解性: H20 (salt form) DMSO (AM form)
分子量: 877g/mol (salt)、1047g/mol (AM)
四、操作说明
加载细胞，建议使用膜透性的 AM 酯类形式的探针，如下操作建议仅供参考。
1. 合适培养基稀释一份染料的 DMSO 储液（1mM）到 1~5μM 的终浓度，加入非离子型去污剂 Pluro
2. 有机阴离子转运抑制剂 probenecid（1~2.5mM）或 sulfinpyrazone (0.1–0.25 mM)可以添加到细胞培养基中，以减少探针在胞外的脱酯现象。Probenecid 和 sulfinpyrazone 储液基本为碱性，因此在添加到培养基中时需要先调整到与所用培养基匹配的 pH。
3. 细胞通常可以与 AM 酯探针在 20~37 度条件下孵育 15~60 分钟，的探针加载浓度、时长与温度需要在实验中具体摸索确定。一般来说为了减少可能的毒性超负荷，只要满足足够的荧光检测强度，选择尽可能低的染料浓度。此外，由于亚细胞结构的分区化特点，AM 酯加载技术存在固有的标记问题，这可以通过降低孵育温度来解决。
4. 在进行荧光检测之前，细胞应用无指示剂的培养基（允许的话，可以添加阴离子转运抑制剂）充分洗涤，以确保洗去细胞表面的非特异性染料吸附，再另外以新鲜培养基孵育 30 分钟保证胞内酯酶水解充分进行。这里，可能会有少量的指示剂逸出胞外从而产生背景荧光，可以通过临将上机检测之前，在外培养基中添加抗荧光素抗体，来降低背景。
5. 高通量筛选： 96 孔或 384 孔测量细胞内 Ca2+是高通量筛选必不可少的工具之一。AM 酯加载到微孔板中细胞样本的操作可以参考Cell Loading Guidelines.
