Ca2+GPCR 分析-钙离子指示探针 Fluo-3
Cat number：KFS168
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For Research Use o
一、产品描述
Fluo-2 早是由 Roger Tsien 博士发明的钙离子指示剂 Fluo 系列之一，目前，Fluo-3 和 Fluo-4 已成熟商品化。然而，Fluo-2 在细胞内比 Fluo-4 要更明亮，主要可能是由于大部分细胞对 FLuo-2 的加载能力要高于 FLuo-4。
Fluo-3 成像涉及到钙离子信号通路的多个方面，Fluo-3 经常应用在流式细胞术上，如螯合剂光活化、第二信使、神经递质以及细胞水平的药理筛选。Fluo-3 在这些应用里之所以能大量运用主要是由于其几个重要特性：Fluo-3 可以被氩离子激光器 488nm 激发，并在与 Ca2+结合后，发射荧光很明亮的荧光信号。Fluo-4 是 Fluo-3 以两个氟原子取代氯原子的类似物，这一微小的结构变化使得 Fluo-4探针在 488nm 激发光下的荧光信号得到增强，信号稳定持续，可以应用于共聚焦显微镜、流式细胞仪、微孔板读数仪。
Fluo-2、Fluo-3 和 Fluo-4 在与 Ca2+结合后荧光增强，与紫外激发的探针 fura-2 和 indo-1 不同，不会发生光谱漂移。荧光光密度在与Ca2+结合后，增强至少 100 倍。Fluo-2、Fluo-3 和 Fluo-4 的光谱特性，见下表.
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Property |
Fluo-2 |
Fluo-3 |
Fluo-4 |
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Kd (Ca2+) |
390 nm |
325 nm |
345 nm |
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Excitation |
490 nm |
506 nm |
494 nm |
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Emission |
515 nm |
526 nm |
516 nm |
二、产品包装
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组份 |
KFS168 |
储存条件 |
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Fluo-3, AM |
1 mg |
-20℃，避光 |
三、理化性质
分子式: C51H50Cl2N2O23
分子量: 1129.85
外观: 红色粉末
别名: Fluo 3-AM
纯度: 85%以上（HPLC）
溶解性：DMSO
四、操作说明
下面操作可能需要用到的 20% Pluro
1. 合适培养基稀释一份 DMSO 储液（1mM）到 1~5μM 的终浓度，加入非离子型去污剂 Pluro
协助非性的 AM 酯在水溶液中的扩散。可以简单的通过先等体积混合 20%（w/V）的 Pluronic 与 DMSO，确保 Pluronic 在加载到细胞中的工作浓度是 0.02%。
2. 有机阴离子转运抑制剂 probenecid（1~2.5mM）或 sulfinpyrazone (0.1–0.25 mM)可以添加到细胞培养基
中，以减少探针在胞外的脱酯现象。Probenecid 和 sulfinpyrazone 储液基本为碱性，因此在添加到培养基中时需要先调整到与所用培养基匹配的 pH。
3. 细胞通常可以与 AM 酯探针在 20~37 度条件下孵育 15~60 分钟，的探针加载浓度、时长与温度需要
在实验中具体摸索确定。一般来说为了减少可能的毒性超负荷，只要满足足够的荧光检测强度，选择尽可能
低的染料浓度。此外，由于亚细胞结构的分区化特点，AM 酯加载技术存在固有的标记问题，这可以通过降
低孵育温度来解决。
4. 在进行荧光检测之前，细胞应用无指示剂的培养基（允许的话，可以添加阴离子转运抑制剂）充分洗涤，以
确保洗去细胞表面的非特异性染料吸附，再另外以新鲜培养基孵育 30 分钟保证胞内酯酶水解充分进行。这
里，可能会有少量的指示剂逸出胞外从而产生背景荧光，可以通过临将上机检测之前，在外培养基中添加抗
荧光素抗体，来降低背景。
5. 高通量筛选96 孔或 384 孔测量细胞内 Ca2+是高通量筛选必不可少的工具之一。AM 酯加载到微孔板中细胞
样本的操作可以参考 Cell Loading Guidelines.
