1.绘制标准曲线:各标准品 OD 值减去底色即减去空白孔 OD 值,以 6 个标准品的 OD 值为纵坐标 y,以标准品的浓度为横坐标 x,绘制曲线图,并计算出回归方程 y=ax+b。
2.将待测样品的 OD 值代入方程式,计算各组样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际 IFN-γ浓度。
3.敏感度:1.0ng/L
实验材料与试剂配制:
1.仪器与材料:酶标仪(使用前预热30分钟),微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水,滤纸。
2.洗液的配制:按1:30的比例配制洗液备用。
样品收集、处理及保存
1.细胞培养上清:适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液,以1000×g离心15分钟,收集上清。
2.细胞:用PBS反复洗涤细胞3次,调整细胞浓度达到104-106/ml 左右,通过反复冻融,使细胞破坏并放出细胞内成份,或者细胞超声粉碎,离心取上清液检测。
3.血清:在室温下,血液自然凝固,以1000×g离心15分钟,取上清待测。
4.血浆:应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合后静置10-20 分钟后,以1000×g离心15分钟,收集上清。
5.体液:包括胸腹水、脑脊液,分泌物等。使用不含热原和内毒素的离心管收集,以1000×g离心15分钟,收集上清。
6.组织标本:切取组织标本,称取重量0.5mg,加入500ul 的PBS,用手工或匀浆器,或超声破碎仪将标本匀浆,以2000-3000rmp离心20 分钟,收集上清进行检测。
7.样品中不能含有NaN3,因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
8.保存:如果样品不能立即检测,应将其分装,-70 ℃保存,避免反复冷冻。保存过程中如出现沉淀,应再次离心。血液标本尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
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