One-Step IHC Assay( DAB,compatible for Rabbit & Mouse)
产品货号：KFS029
储存条件：4℃ for 12 months, protected from light
For Research Only
一、试剂盒说明
试剂盒可用于免疫组织化学方法以显示抗原的分布。适用于常规福尔马林固定石蜡包埋切片、冰冻切片、培养固定的细胞涂片，以及新鲜制备的血涂片等。即用型一步法免疫组化检测试剂盒与常规免疫组化染色试剂盒相比，具有高灵敏性、高特异性及操作简便的优点。多个HRP聚合物直接与二抗相连，大大放大了抗原抗体结合的信号，减少了孵育步骤，孵育时间缩短为10分钟。试剂盒不含有生物素，完全避免了内源性生物素造成的背景影响。试剂盒提供的DAB显色试剂为增强型显色试剂，且自带稀释液，避免了由于水质的不同对DAB显色造成的影响；与一般DAB试剂相比，增强型的稳定性显著提高，显色更醒目，敏感性更高。
二、试剂盒组份
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组份 |
KFS028（60 片） |
KFS029（300 片） |
保存条件 |
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试剂A：10%山羊血清封闭液 |
3 ml |
15 ml |
2-8℃ |
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试剂B：HRP 聚合物(即用型) |
3 ml |
15 ml |
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试剂C：增强剂 |
3ml |
15ml |
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试剂D：20 倍浓缩DAB 底物缓冲液 |
160 μl |
800μl |
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试剂E：20 倍浓缩DAB 显色液 |
160 μl |
800μl |
2-8℃，避光保存 |
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试剂F：20 倍浓缩底物溶液 |
160 μl |
800μl |
2-8℃ |
三、试剂盒以外自备仪器和试剂
二甲苯、乙醇、无水甲醇、蒸馏水或去离子水、30％ H2O2、10 mM PBS（pH 7.4）、一抗（兔或鼠来源一抗抗体）、苏木素染液、封片胶、显微镜。
四、使用注意事项
1. 检测标本时需同时做阴性对照和阳性对照。
2. DAB 是一潜在致癌物，使用时请注意自我防护。
3. DAB 显色液需现用现配，避光放置，且在30 分钟内染色。
4. 用滴瓶加液时，每一滴的体积为50μL。
五、推荐操作方法（以石蜡切片为例）
1. 标本制备
石蜡切片用二甲苯常规脱蜡、入水、抗原修复（可根据一抗说明书推荐方法进行操作）。染色前用PBS 浸泡组织或细胞涂片10 分钟。
（注意：从此步骤起，严禁标本或组织切片干燥）
2. 染色
1) 石蜡切片放入3％H2O2-甲醇液中浸泡10 分钟，以消除内源性过氧化氢酶的作用。用
PBS 洗3 次，每次2min。
2) 加一滴试剂A于组织切片上（需完全覆盖待检组织）孵育30 分钟。倒掉或吸干液体（不要冲洗）。
3) 每张切片加二滴（100μL）或适量一抗（需完全覆盖待检组织），湿盒内室温孵育
30～60 分钟或4℃过夜。建议参见每种抗体的说明书。PBS 洗3 次，每次2min。
4) 每张切片加一滴试剂B（需完全覆盖待检组织），孵育30 分钟。用PBS洗3 次，每次2min。
5) 每张切片加一滴试剂C（需完全覆盖待检组织），孵育30 分钟。用PBS洗3 次，每次2min。
6) 制备DAB显色液（需现用现配；可根据需要一次染多张切片）
以染一张切片为例：①取2.5μL试剂D加入到50μL蒸馏水中，混匀。②取2.5μL试剂E、2.5μL试剂F加入①中，混匀。（避光放置，30min 内使用）。
7) 每张切片加一滴上述DAB 显色液，室温显色2～5分钟（可在镜下掌握显色程度）。
8) 自来水冲洗2min；苏木素复染；如有必要，可用0.1%HCl-酒精分化，自来水冲洗，PBS(或氨水)返蓝。
9) 切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
六、结果：阳性结果为在抗原定位处染棕黄或棕褐色。
七、可能出现的问题及解决办法
1. 脱蜡不彻底，容易出现非特异性背景染色，建议免疫组化切片脱蜡与常规HE 脱蜡分开。
2. 操作过程中冲洗不充分，容易出现非特异性背景染色，需严格控制冲洗时间与次数。
3. 为防止可能出现的假阳性、假阴性结果，建议在实验过程设置阳性与阴性对照。
4. 操作中滴加试剂时缓冲液PBS 未沥干致使试剂稀释，将引起染色强度变弱或假阴性发
生。因此，每步滴加试剂前应将组织片上的 PBS 液除干，但又必须预防干片。
