Oct-4I IHC Assay
产品编号：KFS018
储存条件：2-8℃ 保存，有效期 6 个月
For Research Use Only
一、试剂盒说明
本试剂盒可用于免疫组织化学方法以显示人、大、小鼠来源的组织样本Oct-4抗原分布。
本试剂盒适用于常规福尔马林固定石蜡包埋切片、冰冻切片、培养固定的细胞涂片等。即用型一步法免疫组化检测试剂盒与常规免疫组化染色试剂盒相比，具有高灵敏性、高特异性及操作简便的优点。多个HRP聚合物直接与二抗相连，大大放大了抗原抗体结合的信号，减少了孵育步骤，孵育时间缩短为10分钟。试剂盒不含有生物素，完全避免了内源性生物素造成的背景影响。试剂盒提供的DAB显色试剂为增强型显色试剂，且自带稀释液，避免了由于水质的不同对DAB显色造成的影响；与一般DAB试剂相比，增强型的稳定性显著提高，显色更醒目，敏感性更高。
二、试剂盒组份
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组份 |
50 tests |
备注 |
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Oct-4 兔多抗 |
50 μl |
2-8℃/-20℃ |
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增强剂 |
3 ml |
2-8℃ |
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HRP 聚合物 (即用型) |
3 ml |
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试剂 A：20×DAB 底物缓冲液 A |
160 μl |
2-8℃，避光 |
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试剂 B：20×DAB 底物缓冲液 B |
160 μl |
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试剂 C：20×DAB 底物缓冲液 C |
160 μl |
备注：抗体在 2-8℃可以保存 6 个月，长期保存可以分装保存于-20℃。
三、试剂盒以外自备试剂和仪器
二甲苯、乙醇、蒸馏水或去离子水、3%H2O2-甲醇、10%山羊血清封闭液、10 mM PBS（pH 7.4）、免疫组化笔、苏木素染液、封片胶、显微镜。
四、使用注意事项
1. 检测标本时需同时做阴性对照和阳性对照。
2. 增强剂中含有 0.1% ProClin 300 防腐剂，使用时请注意自我防护。
3. DAB 显色液需现用现配，避光放置，且在 2 小时内染色。
4. 在超过有效期的试剂盒中一种或多种试剂的活性可能降低，因此不得使用过期的试剂盒，不同批号间试剂盒也不能交叉混用。
五、推荐操作方法（以石蜡切片为例）
1. 石蜡切片二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3min）。（注意：从此步骤起，严禁标本或组织切片干燥）。
2. 抗原修复（选做步骤：石蜡组织切片建议进行蛋白酶K修复20ug/ml，37℃，30min）。
3. 如有必要，每张切片加50μl双氧水-甲醇封闭液（需完全覆盖组织），室温下孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS洗涤3×2min。
4. 除去PBS液，每片加50~100μl的10%山羊血清封闭液（自备），湿盒内室温或37度孵育30分钟。PBS洗涤3×2min。
5. 除去PBS液，每张切片加50~100μl的Oct-4兔多抗(用户根据实验需要进行自选，用量体积按
完全覆盖组织为准，建议抗体稀释比例为：固定细胞1:100-500；冰冻切片1:100-500；石蜡切片1:50-200)，湿盒内室温（或37度）孵育60分钟或4℃过夜。PBS洗涤3×2min。
6. 除去PBS液，每张切片加50μl增强剂（需完全覆盖组织），室温下（或37度湿盒）孵育30
分钟。PBS洗涤3× 2min。
7. 除去PBS液，每片加50μl HRP聚合物（需完全覆盖组织），室温下（或37度湿盒）孵育
30分钟。PBS洗涤3× 2min。
8. 制备DAB显色液（需现用现配；可根据需要一次染多张切片），以染十张切片为例：取25μl试剂A加入到425μl超纯水中，再加入25μl试剂B和25μl试剂C，混匀。（避光放置，2小时内使用）
9. 除去PBS液，每张切片加50μl~100μl新鲜配制的DAB显色液（需完全覆盖组织），室温下
孵育5分钟，显微镜下观察控制显色时间。
10. 自来水冲洗2min；苏木素复染；如有必要，可用0.1%HCl分化，自来水冲洗，PBS返蓝。
11. 切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
六、结果： 阳性结果为在抗原定位处染棕黄或棕褐色。
七、可能出现的问题及解决办法
1. 脱蜡不彻底，容易出现非特异性背景染色，建议免疫组化切片脱蜡与常规HE脱蜡分开。
2. 操作过程中冲洗不充分，容易出现非特异性背景染色，需严格控制冲洗时间与次数。
3. 为防止可能出现的假阳性、假阴性结果，建议在实验过程设置阳性与阴性对照。
4. 操作中滴加试剂时缓冲液PBS未沥干致使试剂稀释，将引起染色强度变弱或假阴性发生。因此，每步滴加试剂前应将组织片上的PBS液除干，但又必须预防干片。
