小鼠钙结合蛋白(CR)检测试剂盒使用说明书

（1）待测样品孔中每孔加入待测样品100μl，每种样品设3个平行孔；设两个阴性对照孔，每孔加未处理组的细胞裂解液100μl；另设一个空白对照孔，加入纯细胞裂解液100μl。　（2）酶标板置4℃，包被过夜。

（3）洗板：吸干孔内反应液，用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去），之后将洗涤液注满板孔，浸泡1-2分钟，间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。

（4）阴性对照孔每孔加入pbs 50μl，样品孔及空白孔每孔加入1：500稀释的兔抗人aif抗体工作液50μl。　

（5）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。　

（6）洗板，同（4）。　

（7）每孔加1：5000稀释的hrp-标记的山羊抗兔抗体工作液 100μl。　

（8）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。　

（9）洗板，同（4）。　

（10）每孔加tmb显色液 100μl，轻轻混匀10s，置37℃暗处反应15-20min。　

（11）每孔加100μl 2mol/l h2so4终止反应。　

（12）分别测450nm 吸光值w1和630nm吸光值w2，终测得的od值为两者之差（w1-w2），以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。

（13）数据处理：在得出标本（s）和阴性对照（n）的 od值后，计算s/n值。s/n≥2.1为阳性判定标准。

注：所用溶液配方

(1) pbs：称取0.2g kh2p04, 2.9g na2hp04?12h20、8.0g nacl, 0.2g kcl，加双蒸水至1000ml。

（2）包被缓冲液：称取1.59g na2co3, 2.938 nahco3，加双蒸水至 1000m1。

（3）洗涤液(pbst)：含0.05% tween-20的pbs。

（4）稀释液：含0.1%牛血清白蛋白(bsa)的pbs，主要用以稀释抗体、标准品、样品。

（5）tmb显色液：称取1.84g na2hp04.12h20, 0.51 g柠檬酸，加双蒸水至1o0ml，配成柠檬酸-磷酸缓冲溶液。用10.5 ml 柠檬酸-磷酸缓冲溶液溶解1锭tmb，再加入35μl 3% h2o2

（6）细胞裂解液：1% tritonx-100，137mmol/l nacl，20mmol/l tris-hcl，2mmol/l edta，1mmol/l pmsf，ph 7.4。（其中pmsf溶于异丙醇中，配成1o mmo/l，-20℃ 贮存备用。
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