1. 工作原理
辣根过氧化物酶（HRP）由于在辣根中的含量很高，故命名。它的分子量在
40000 左右，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺等聚合，它不会遮盖抗原的结
合部位，具有较高活性及特异性，生成的产物不易扩散，可作用于多种底物，产
生不同颜色且HRP 穿透力强，易进入细胞内。DAB 在H2O2 存在的情况下，可
以作为HRP 的电子供体，产生褐色的不溶颗粒，可作为显色的试剂。
2. 试剂盒组成 (推荐切片数50～100pcs)
试剂名称 规格 备注
5% BSA 15mL 5%BSA 血清封闭液
二 抗 0.1mL HRP 标记二抗，根据需求稀释成适当比例
H2O2 10 mL 3% H 2 O 2 消除内源性过氧化物酶的活性
DAB 显色液10 mL 已按需求配制成合适浓度
枸橼酸盐缓冲液 1Pack 根据具体需求配制成想要的浓度
3. 操作步骤
3.1. 防脱片剂处理： 可选择 APES 或Poly-Lysine。捞片后置烤箱30-60 min（设
定温度58-60 ℃）以使切片紧密粘附。
3.2. 常规脱蜡至水： 防脱片剂处理后的切片在二甲苯中脱蜡，将石蜡切片先后
浸入二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ各10min。然后逐级降浓度酒精入水，每次3-5 min。
① 无水酒精 3－5min
② 90% 酒精3－5min
③ 85% 酒精3－5min
④ 75% 酒精3－5min
⑤ 0.01mol/L pH7.4 PBS 洗涤3 次每次 5 min
（以上是本试剂盒推荐酒精梯度）
3.3. 消除内源性过氧化物酶：用3% H 2 O 2 室温孵育 5-10 min，以消除内源性
过氧化物酶的活性。PBS 洗涤2-3 次，每次5 min；
3.4. 热修复抗原： 将切片置于 0.01mol/L pH6.0 柠檬酸缓冲液，电炉或微波炉
免疫组织化学(IHC)系列试剂盒
加热至沸腾后断电，间隔5-10 min 后，反复1-2 次，置于室温自然冷却。
0.01 mol/L pH7.4 的PBS 洗涤3 次，每次5 min 。
3.5. 封闭： 加封闭液（5%BSA），于湿盒中室温感作30min，然后甩去多余的
封闭液，不洗；
3.6. 滴加一抗： 滴加适当稀释的一抗到切片上，37℃孵育1小时左右或者4℃过
夜， 然后0.01 mol/LpH7.4的PBS洗涤3次，每次5 min 。（一抗的稀释度、
孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度
不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度
和缩短孵育时间。）
3.7. 滴加二抗： 滴加二抗，覆盖切片，置湿盒中 37℃感作30min 左右（以锡
纸避光即可），取出后洗涤（方法同4）。
3.8. DAB 显色： 取 DAB 显色液加至切片，室温显色, 镜下控制反应时间，一
般显色10-30min。若无背景出现则可继续显色。蒸馏水充分洗涤以终止反
应。
3.9. 苏木素轻度复染 1min 左右，蒸馏水充分洗涤以终止反应。
3.10. 脱水，透明，中性树胶封片。显微镜观察。
2-8℃保存，注意避免冷冻。
有 效 期 一年
生产日期 见封口
