猪繁殖与呼吸综合征病毒通用实时荧光RT-PCR检测试剂盒

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用实时荧光RT-PCR检测试剂盒

本公司专业研究及经营农兽药残留检测试剂、生化试剂、酶及农药兽药残留检测专用酶、标准品、固相萃取柱、色谱柱、实验室仪器设备等实验耗材的新技术推广，公司所代理的产品均为我国农牧业系统内科研单位及相关检测机构认可并广泛推广使用的国内外知名品牌。产品质量稳定，技术可靠。公司依托于多家农牧业系统的科研单位和相关检测机构，并且建立了良好的技术合作关系。公司拥有一批从事食品化学分析、农药兽药残留检测工作的专业技术人员，可随时为用户提供最完善的检测技术咨询服务，并为初步涉及农产品、畜产品检测单位提供实验室整体方案设计及技术人员培训等全程技术指导工作。 专业研究及经营农兽药残留检测试剂、生化试剂、酶及农药兽药残留检测专用酶、标准品、固相萃取柱、色谱柱、实验室仪器设备等实验耗材并广泛推广国内外知名品牌

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用实时荧光RT-PCR检测试剂盒
猪繁殖与呼吸综合征病毒通用实时荧光RT-PCR检测试剂盒
猪繁殖与呼吸综合征病毒通用实时荧光RT-PCR检测试剂盒
北京威瑞谷生物技术有限公司

：张先生

：

QQ ：1300824173

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用实时荧光RT-PCR 检测试剂盒

【产品名称】

通用名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒通用实时荧光RT-PCR 检测试剂盒

英文名称：Porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）real-time RT-PCR Test Kit

【包装规格】50 份/盒

【预期用途】

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用实时荧光RT-PCR 检测试剂盒，采用实时荧光反转录聚合酶链反应（real-timeRT-PCR ）技术检测猪血清和组织中的PRRSV，适用于PRRSV 的检测、诊断和流行病学调查。

【检测原理】

利用吸附柱提取RNA 作为模板，在反转录酶的作用下，以引物为起点合成与RNA 模板互补的cDNA 链；然后

在DNA 聚合酶的作用下，经高温变性、低温延伸的多次循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。经荧光素

标记的探针与扩增的DNA 杂交，利用DNA 聚合酶的5′→3′外切酶活性，使荧光探针的报告基团与淬灭基团分离，

发出特异性荧光信号；利用荧光PCR 仪检测特异性荧光信号，并根据样品Ct 值的大小及扩增曲线的形成情况判定结

果。

【主要组成成份】

大盒

（室温保存）

序号名称规格（50T） 序号名称规格（50T）

1 裂解液35mL 5 洗脱液1mL×2

2 BME 400μL 6 吸附柱和收集管52 套

3 异丙醇35mL 7 8 联PCR 反应管7 条

4 洗涤液35mL×2

小盒

（-20℃保存）

8 阴性对照1mL 10 RT-PCR 反应液A 558μL×2

9 阳性对照1mL 11 RT-PCR 反应液B 80μL

【储存条件及有效期】

储存条件详见【主要组成成份】，本试剂盒有效期为6 个月。

【适用仪器及材料】

1. 设备：分析天平、离心机（12000 转/分钟）、荧光PCR 仪、-20℃冰箱。

2. 器材：眼科剪、眼科镊、组织研磨器（研钵或匀浆器）、一次性注射器、可调移液器（2.5μL、20μL、200 μL、

1000 μL）、计时器。

3. 耗材及试剂：生理盐水、无RNA 酶的1.5 mL 离心管和吸头（10μL、200 μL、1000 μL）、灭菌蒸馏水。

【样品要求】

1. 病死或扑杀的猪，取肺、扁桃体和脑等组织。

2. 待检活猪，用注射器取血5 mL。

3. 立即检测或短期内2～8 ℃保存，避免反复冻融。

【检验方法】

一、样品制备

1. 组织样品的处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.1g 于研磨器中磨碎，

再加1mL 生理盐水继续磨至无块状物；然后将样品转至1.5 mL 灭菌离心管中，8000 rpm 离心2 min，取200 μ

L 上清于1.5 mL 灭菌离心管中。

2. 全血样品的处理：待血凝后取200 μL 血清于1.5 mL 灭菌离心管中。

3. 阳性对照的处理：混匀后，8000rpm 离心2min，取200 μL 上清于1.5 mL 灭菌离心管中。

4. 阴性对照的处理：取200 μL 于1.5 mL 灭菌离心管中。

二、病毒RNA 的提取

1. 往裂解液中加入BME 340μL，充分混匀。（加入了BME 的裂解液须置于4℃保存）

2. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入600μL 裂解液，上下颠倒混匀8～10 次，室温静置10min 。

3. 加入600μL 异丙醇，上下颠倒混匀5 次。

4. 吸取650μL 混合液转入吸附柱，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。

5. 重复步骤4。

6. 向吸附柱中加入600μL 洗涤液，12,000 rpm 离心45s，弃去收集管中液体，套回收集管。

7. 重复步骤6。

8. 空柱12,000 rpm 离心2 min。

9. 将吸附柱移入新的无RNA 酶的1.5 mL 离心管中，在吸附柱膜中央加入25μL 洗脱液，室温静置1min，12,000 rpm

离心45s，获得总RNA。立即检测或-20℃保存。

三、实时荧光RT-PCR

1. 反应体系配制：每份总体积25 μL，按下表配制，充分混匀，并作好标记。

试剂用量

RT-PCR 反应液A 21μL

RT-PCR 反应液B 1.5μL

模板RNA 2.5μL

2. 反应程序：在荧光PCR 仪上进行以下反应：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3min；循环95 ℃ 5 s，58℃ 40 s，共40 次，

在每次循环第二步（58℃ 40s）收集FAM 荧光信号（报告基团“FAM”，淬灭基团“None”）。

【参考值】阳性对照Ct 值≤30.0 且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct 值或Ct 值=40 时，实验成立。

【检验结果的解释】

1 结果分析条件设定

阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的zui高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。

2 结果描述及判定

当被检样品出现典型的扩增曲线且Ct 值≤30.0 时为猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性，无Ct 值为猪繁殖与呼吸综合征

病毒阴性；对于Ct 值＞30.0 的样品，应重检，Ct 值＞38.0 的样品判为阴性，Ct 值≤38.0 的样品判为阳性。

【注意事项】

1．各试剂须在规定的温度储存。

2．本试剂盒有效期为6 个月，不要使用超过有效期的试剂。

3. 严格遵守说明书操作，可以获得的实验结果，移液、定时等全部过程必须。

4．保存于-20℃的试剂使用前须完全融化，并充分混匀，8000rpm 离心15s，使液体全部沉于管底，放于冰盒中，吸

取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取，使用后立即放回-20℃。

5. 反复冻融试剂将降低检测的灵敏度，建议3 次内用完。

6．注意防止试剂盒组份受污染，不同试剂盒之间的组份不要混用。

7．RNA 提取过程中，须戴口罩、勤换手套，尽量缩短操作时间，避免RNA 酶污染。

8. BME 含有对人体有害的物质，室温下避光保存，且避免直接接触。

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