1. 产品概述
产品描述
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)为即用型、2×浓度的反应混和液，该产品包含了基于SYBR Green I检测模式的qPCR和两步法qRT-PCR进行实时DNA检测时所需的所有试剂(除了引物与模板)。该试剂内含参比染料ROX，适用于所有需要ROX校正的实时荧光定量PCR平台。
储存条件及其稳定性
该产品在-15~-25°C条件下可稳定存放至标签上的有效期之前。若存放于+2~+8°C条件下，则可短期储存（不超过1个月）。
注意：请将该产品避光保存。
请避免将该产品反复冻融。
该反应液添加引物与模板后可在+15~+25°C及避光条件下稳定储存24小时。
该产品用干冰运输。
2. 产品使用方法
2.1 实验前准备
实验反应条件(包括DNA模板和PCR引物浓度、孵育温度和时间、循环次数)应根据特异性模板/引物而异。
样本准备
请使用纯度、浓度经优化摸索且不含PCR抑制物的DNA模板(如，基因组学或质粒DNA，cDNA)。为获得高重复性的核酸分离产物，请使用以下试剂：
- MagNA Pure LC或MagNA Pure Compact系统结合系统配套的核酸分离试剂盒用于核酸自动分离。
- 手动分离请使用High Pure Nucleic Acid Isolation Kit。
更多详细信息，请阅读罗氏应用科学部生化产品目录，或访问罗氏应用科学部主页 www.roche-applied-science.com.
请使用至多250 ng基因组DNA或50 ng cDNA。
请将DNA模板储存于PCR级别的水中或5 – 10 mM 的Tris/HCl(pH 7.5-8.0)中。由于EDTA与镁离子会形成敖合物，故请避免将模板溶解于TE缓冲液。
引物
PCR引物的终浓度为0.1 – 0.4 μM。建议初次试验时每种引物的浓度为0.3 μM。
注意：实验中使用的引物对浓度相等。
PCR引物的设计决定了扩增子长度、熔解温度、扩增效率及产量。引物设计同时也取决于PCR程序的选择(两步法与三步法)。
引物设计可通过实时PCR系统供应商(如，PrimerExpress)提供的相关设计程序，或者您可以在网上获取相应的信息(如，Primer3: http://frodo.wi.mit.edu/)。
如果您想在后续实验中用水解探针检测您的实验结果，请选择熔解温度(Tm)在+58~+60°C之间的引物。您也可以采用罗氏应用科学部通用探针库提供的预测试的探针来进行验证SYBR Green I检测。与通用探针库的探针相对应的PCR引物的设计，请参考在线ProbeFinder 软件 www.universalprobelibrary.com。
阴性对照
为了检测DNA污染物，在阴性对照组中将DNA模板替换成PCR级别的水。
反应体积
FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)适用于多种不同体积的反应体系，反应中使用的反应管/板及合适的反应液体积，请参考不同仪器供应商的建议。
内参染料ROX
原则上，实时PCR系统(除LightCycler系统外)提供了两种不同的检测方法：
结合内参染料(通常为ROX)的检测来校正各管SYBR Green I荧光信号。
单独检测SYBR Green I荧光信号。
检测方法的选择取决于所用仪器(如，是否具有检测内参染料荧光信号的通道)及仪器光源(卤素灯或激光)。
含ROX内参染料的FastStart Universal SYBR Green Master被证实无需调整其ROX的浓度即可用于ABI仪器(ABI PRISM 7000 测序系统、ABI 7300 实时PCR 系统、ABI 7500 实时PCR 系统、ABI 7700 测序系统以及ABI PRISM 7900 HT 快速实时PCR系统)，也可用于Stratagene Mx3000P QPCR 系统。
注意：如果您不使用实时PCR系统的参比通道或您的系统不配备参比通道，请选择FastStart SYBR Green Master (without ROX)。
如果您使用Bio-Rad iCycler iQ5 实时PCR检测系统，请选择Universal SYBR Green Master (without ROX)，并参考Bio-Rad iCycler iQ5 实时PCR检测系统指导手册进行External Well Factor Plate步骤以检测孔道因子。
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