作为由微生物长期进化而形成的获得性免疫系统，CRISPR-Cas能够对各种方式的入侵产生特异的防御，比如质粒的转化或结合、噬菌体的感染等。该防御过程包括3个阶段：一是新间隔序列的获取，称适应阶段；第二是crRNA的合成，即CRISPR基因座的表达；第三是对外来核酸的抵御，称干扰阶段。上述提及的不同系统在这3个阶段存在一定的差异。
CRISPR-Cas系统适应阶段
当外源核酸入侵含有CRISPR-Cas系统的生物体，宿主先对其进行识别和扫描，之后通过相关蛋白将其捕获并整合至先导序列下游，形成新的间隔序列。对于大多数的CRISPR系统，外源核酸的识别与选择依赖于原间隔序列邻近的2–5个核苷酸，称PAM序列，它除了在整合阶段发挥作用，还能够指导系统对外源核酸进行特异切割，从而避免宿主发生自身免疫。
Ⅰ型系统在该阶段通过两种方式捕获外源核酸。当噬菌体次入侵生物体，宿主采用“naive”方式整合外源DNA，利用RecBCD、限制核酸酶或系统相关核酸酶将外源DNA处理成小片段，Cas1-Cas2复合物扫描PAM序列选择合适片段，通过亲核进攻和非Cas蛋白修复系统将片段整合至基因座中。
若系统已整合间隔序列，噬菌体再次入侵则采用“primed”方式获取外源DNA，该过程包含Cas3处理DNA和Cas1-Cas2复合物对合适片段整合等过程。Ⅱ型中Cas9-tracrRNA复合物同Cas1-Cas2复合物参与到对外源核酸整合过程，有研究表明Ⅱ-A亚型的Csn2和Ⅱ-B亚型的Cas4也参与其中。Ⅲ型中Cas1蛋白能与逆转录酶融合，将RNA片段直接整合至系统中。
CRISPR基因座表达阶段
CRISPR基因座表达的起始产物为长达30–65 nt的pre-crRNA，经过相关Cas蛋白和RNA核酸酶的加工形成成熟crRNA，此过程即为CRISPR基因座的表达。
一大类系统中，Cas6蛋白不依赖于金属离子识别前体crRNA的重复区域并进行切割，对前体crRNA进行加工。Ⅰ-C亚型因缺乏Cas6，由Cas5d蛋白代替参与到该过程中，Ⅲ型往往也缺乏该类蛋白，通过利用孤立的类似Cas6核酸酶来负责加工过程，比如嗜热细菌HB8。
第二大类中，Ⅱ型系统的tracrRNA先与前体crRNA部分序列互补配对形成复合物，Cas9蛋白稳定复合物状态，随后内源性RNA核酸酶对前体crRNA的重复序列区域剪切进行加工；Cpf1及C2c2分别是Ⅴ型和Ⅵ型系统的重要蛋白，利用自身RNA核酸酶活性对前体crRNA进行加工。
CRISPR-Cas系统干扰阶段
干扰阶段是防御入侵重要的一步，主要通过RNA介导准确识别外源核酸并对其进行剪切。一大类系统的多亚基效应复合物和第二大类系统的单效应蛋白在此阶段发挥重要作用。
一大类系统中，Ⅰ型系统效应复合物由Cas蛋白和成熟crRNA构成。在该过程起始，效应复合物中Cse1亚基识别靶标DNA的PAM序列并与之结合，造成DNA从PAM端逐渐解开，进一步crRNA与目标DNA结合形成稳定的复合物从而使效应复合物构象发生变化，招募Cas3蛋白对目标DNA进行解旋并切割，后切割产物ssDNA作为底物被其他核酸酶彻底降解以达到防御目的。
同属一类的Ⅲ型，Csm和Cmr系列蛋白为效应复合物的结构与Ⅰ型的有一定相似性，但作用机理存在差异，区别在于Ⅲ型系统依赖于crRNA或相关蛋白识别自身和外源核酸，非PAM序列。此外，上述提到Ⅲ型系统能够干扰RNA是由Cmr效应复合物负责，另一亚型系统Csm效应复合物则靶向DNA，有研究表明Csm复合物能靶向DNA和RNA以及两种亚型复合物是依赖于转录的DNA核酸酶。
第二大类中，Ⅱ型系统的Cas9蛋白与crRNA和tracrRNA形成效应复合物对外源DNA进行干扰，复合物中Cas9蛋白通过识别原间隔序列3′端PAM序列靶向DNA使其解旋，同时crRNA与之互补配对形成R环结构，随后Cas9蛋白的核酸酶结构域构象发生变化并切割DNA。
Ⅴ型系统与Ⅱ型相似，Ⅴ-B亚型的C2c1蛋白在tracrRNA的协助下切割外源核酸，Ⅴ-A亚型的Cpf1蛋白作为效应因子即可靶向外源DNA。此外，Ⅴ型系统通过识别位于5′端且富含胸腺嘧啶的PAM序列确定目标DNA。在原间隔序列3′端具有特定序列条件下，Ⅵ型的效应蛋白C2c2在crRNA的介导下靶向外源ssRNA并进行切割。