HR0399 Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒

Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒可以方便快捷的检测凋亡细胞，可以使用流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或其它有相应波长的荧光检测设备进行检测。一般最常用的凋亡试剂盒是采用Annexin V-FITC与PI联用。如果细胞本身带有绿色荧光，可以选择其它颜色。...

Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒

 

产品编号：HR0399

产品组成：

储存条件：

2-8℃避光保存，长期保存于-20℃避光，避免反复冻融，多次冻融会导致失效。需要长期保存时可以根据使用情况进行小量分装后-20℃保存。有效期1年。

产品简介：

用标记了FITC 的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

早期凋亡细胞可以与Annexin V-FITC结合，细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞也会结合Annexin V-FITC。Propidium iodide（PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将Annexin V-FITC与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和凋亡晚期的细胞/坏死细胞区分开来。

坏死细胞可以同时与Annexin V-FITC和PI结合显色，而PI则被排除在活细胞（FITC阴性）和早期凋亡细胞（FITC阳性）之外。在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性。

Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒可以方便快捷的检测凋亡细胞，可以使用流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或其它有相应波长的荧光检测设备进行检测。

一般最常用的凋亡试剂盒是采用Annexin V-FITC与PI联用。如果细胞本身带有绿色荧光，可以选择其它颜色。

Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒特点：

● 方便：可用流式细胞仪或荧光显微镜检测；

● 快速：1小时内即可完成实验；

● 准确：能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例。

检测方法：

● 流式细胞仪 ● 激光共聚焦 ● 荧光显微镜 ● 荧光酶标仪

样本类型：

● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞

试剂盒以外自备试剂和仪器

● 流式细胞仪/荧光显微镜/激光共聚焦 ● 移液器 ● 离心机 

● PBS或HBSS ● 铝箔

使用注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。

● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小，重悬细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。

● Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。标记后将细胞保持在避光环境中。移液过程中短暂暴露在光线下（<30秒）是可以接受的。

● 由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。

● 使用Annexin V-FITC试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。

● 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

● 如果细胞样品中含有血小板，如血液样品，请使用含有EDTA的缓冲剂并200g离心洗去血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合。从而影响实验结果。

● 流式细胞仪检测时，细胞数量应不低于1×10⁵。

● 如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意用PBS 洗净去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，最终导致染色失败。

● 贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。中晚期凋亡细胞失去贴壁能力而漂浮于培养基，此部分细胞对结果有显著影响，不可随意丢弃，需离心后收集与贴壁细胞一起检测，才能全面的反映出细胞凋亡的整体情况；

● 对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞，胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC 的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA，EDTA影响Annexin V与PS的结合。

● 成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS 的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间以及实验过程中机械损伤的程度等，把这些影响因素进行优化对实验成功与否至关重要。务必根据每次实验样本类型和操作流程对这些步骤进行优化。

● 在进行流式细胞仪检测之前，事先进行显微镜观察有好处。

● 有极少数细胞株其细胞膜上PS的密度很低，难以染色，此时不适合用Annexin V方法检测凋亡。

● Annexin V染色常见到即使未凋亡的细胞（Annexin V-/PI-细胞），经过染色后在流式图上的位置也会右移。通常通过多次洗涤洗去多余染料来将活细胞群（Annexin V-/PI-细胞群）调整到我们通常认为的“阴性细胞”位置的方法不可行。

● 需要注意，随着时间的推移，PI 染料也是可以进入活细胞的，因此PI 染料应该在分析前加入，短时间内（尽可能小于10分钟）上机。PI染色方案应该标准化。

● Annexin V试剂如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。

● 贴壁细胞原位检测时，注意部分凋亡细胞会由于不贴壁漂浮起来而检测不到。

● 在开始实验之前，请注意磷脂酰丝氨酸翻转是细胞凋亡的早期事件。这种现象可能会在DNA断裂之前几个小时发生，因此，当使用这种方法分析细胞时，应研究药物处理细胞后的早期时间点。

● 不同细胞类型的磷脂酰丝氨酸含量不同，细胞凋亡开始后细胞表面的暴露量也不同。以下方案是是常用的实验指南，但是在各种实际模型样本中，可能有必要调整Annexin V的浓度。通常，Annexin V的1：100稀释是合适的，但是，有些样本可能需要1:200至1：400的稀释度。

● 在与Annexin V-FITC孵育之前，不能固定细胞。

Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒使用方法：

样品染色：

1、离心收集悬浮细胞。离心机约300×g力，2-8℃，离心时间5分钟，弃培养基。

【注】：

● 不同细胞完全沉降的离心力有差异，离心转速根据平时该细胞实验时的转速即可。离心力过大会损伤细胞膜。

● 此处以悬浮细胞为例，贴壁细胞消化后收集。也可以原位染色后观察拍照。

● 贴壁细胞用不含EDTA 的胰酶消化后离心，收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防损伤细胞膜，引起假阳性。

● 贴壁细胞必须将细胞消化好，不可有粘附或者成团，可在消化以后在镜下观察（必须得进行的操作）。不可以将为消化好的细胞用移液器强行吹打下来，可能损伤细胞膜。不可以用细胞刮刀刮细胞，可能损伤细胞膜。

● 检测贴壁细胞时，胰酶消化前，去掉的上清也要保留，因为可能存在一些掉下来的凋亡细胞，在胰酶消化后，再将这些上清加回去，一起检测，结果更加准确。

● 可使用0.25%胰蛋白酶或含0.02%至2% EDTA的PBS或HBSS溶液将贴壁细胞消化下来。用胰蛋白酶消化时要小心，以防止细胞过度损伤。

使用EDTA时，有必要在标记前用1×PBS 或1×结合缓冲液洗涤两次细胞以除去所有EDTA，以避免螯合膜联蛋白结合所需的钙。。

2、用冷PBS洗涤细胞两次。

【注】：

● 300×g-500×g，2-8℃，离心时间5分钟收集细胞

3、用400μL 1×Annexin V结合液重新悬浮细胞，浓度大约为1×10⁶ cells/ml。

【注】：

● 重悬操作需要轻柔，不可以用力吹打，但是要充分混匀。

4、在细胞悬浮液中加入5μL Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15分钟。

【注】：

● 不同细胞类型的磷脂酰丝氨酸含量不同，细胞凋亡开始后细胞表面的PS暴露量也不同。通常，膜联蛋白V的1：100稀释是合适绝大数细胞的，其中Annexin V-FITC的量是过剩的。

● 但是，对有些PS极少的细胞，可能有必要调整膜联蛋白V的浓度，可能需要1:200至1：400的稀释度。

5、加入5-10μL PI染色液后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育2-5分钟。

【注】：

● PI用量可以在染色清晰的前提下尽可能减少。

● 染色时间尽可能短，如果不能及时检测，可以在检测前再加PI。

● 需要注意，随着时间的推移，PI染料也是可以进入活细胞的，因此PI染料应该在分析前加入，短时间内（尽可能小于10分钟）上机。PI染色方案应该标准化。

6、立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

【注】：

● 染色完成后要尽快上机检测，因为细胞在Annexin V结合缓冲液中存活时间不会太长。时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

● 流式仪器上机检测之前，尽可能在显微镜下观测一下，看细胞膜有没有着绿色，细胞核有没有着红色，直接可以观察到早期凋亡和坏死细胞，可以在有根据的情况下去上机检测。

流式细胞仪分析：

上机检测前，必须用待测细胞制备三个质控样本来设定流式细胞仪的荧光补偿和设置十字门的范围：

① 空白管，未染色的细胞：不加Annexin V-FITC，不加PI。用于调节电压。

② 单染管，Annexin V-FITC单染细胞：用明显凋亡的细胞，仅用Annexin V-FITC染色细胞。用于调节补偿。

③ 单染管，PI 单染细胞：仅用PI染色细胞。用于调节补偿。

④ 检测管：待测的处理细胞，加Annexin V-FITC，加PI。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

【注】：

● 具体流式设置按常规方法即可。

● 流式上机检测之前，尽可能在显微镜下观测一下，看细胞膜有没有着绿色，细胞核有没有着红色，直接可以观察到早期凋亡和坏死细胞，可以在有根据的情况下去上机检测。

● 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此每次检测均需进行荧光补偿的调节。

● 要特别注意在FSC/SSC圈门时，所选细胞范围会对结果造成较大影响，分析时要把所有分析对象都圈进FSC/SSC的门内，这样才能反映真实情况。

● 建议点图的X轴反映Annexin V-FITC荧光，Y轴反映碘化丙啶的荧光。凋亡细胞具有变化的光散射特性，这必须在流式细胞仪中进行补偿。未经处理，未标记的细胞应出现在对数点图的左下象限中。进行实验时，必须校准流式细胞仪，以避免两个光电倍增管（PMT）通道之间的光谱重叠。

经处理过的细胞此时可以在流式细胞仪上分析。激发波长为488nm。

按照常规的流式凋亡检测的操作即可。

Annexin V-FITC的绿色荧光发射波长530nm，信号可以通过FL1（FITC接收器）

通道检测；

PI红色荧光在620nm，通过FL2（Propidium iodide接收器）通道或FL3通道检测。

荧光显微镜/激光共聚焦观察：

1、滴加30-50μL用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。

【注】：

● 对于贴壁细胞，可以象悬浮细胞那样染色后， 滴一滴细胞悬液于载玻片上，用盖玻片盖上细胞，荧光显微镜下观察。

● 也可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。根据盖玻片大小，置于24孔或12孔细胞培养板内培养，然后诱导细胞凋亡。细胞染色在细胞培养板内进行。先用PBS 冲洗两次，加入400μL Annexin V结合液于孔中。再加入5μL Annexin V-FITC染色液与10μL Propidium Iodide染色液，混匀。避光室温反应10分钟。

● 用激光共聚焦显微镜检测时，贴壁培养细胞应培养在Confocal专用小培养皿或盖玻片上。

根据实际情况调整染色液的用量，用Annexin V结合液稀释两种染料，终浓度在100倍以内即可。

● 悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片。。

2、在荧光显微镜/激光共聚焦下观察。

使用荧光显微镜上的FITC滤镜（蓝光激发），Annexin V-FITC染色阳性的细胞将在细胞膜表面呈现明亮的苹果绿色。使用PI滤镜（绿光激发），Propidium Iodide染色阳性的细胞则会在整个胞质内呈现不同强度的黄-红色。早期凋亡细胞不会被Propidium Iodide染色或显示背景荧光，而坏死或晚期凋亡细胞则会显示出黄-红色的胞质，红色的胞核和环绕细胞的绿色胞膜。在晚期凋亡细胞中还可以观察到胞膜皱缩和起泡。

【注】：

● 不同仪器的配置不同，以实际为准。

● 在同一个视野中， FITC和PI之间可能存在明显的信号重叠，从而使得结果的解释变得困难。正常情况下，会看到强PI的明亮细胞以及染色较浅的PI细胞。降低标记反应中PI的浓度可能会得到更好的结果。

常见问题分析：

● 实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。可能的原因如下：

1、用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。

2、确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。

3、细胞未启动凋亡。重新确定诱导后凋亡启动的时间点（时程实验）。

4、细胞数量偏少。增加细胞数量。

5、贴壁细胞消化不当。Annexin V跟PS的结合需要Ca²⁺离子，结合液中含有Ca²⁺，EDTA的消化会影响染色，建议使用无EDTA的胰酶，或者消化后用PBS洗涤干净。

6、与抗体结合不同，Annexin V与PS的结合不像抗原抗体的结合那样稳定，也不容易被固定，所以在标记结束后1-2小时内必须要上机检测。

7、细胞离心用冷PBS洗涤后，应尽量吸干残余液体，残余过多的PBS中含有磷酸根，会形成磷酸钙沉淀，影响Annexin V的染色。

8、Annexin V结合液瓶盖要盖紧密封，长时间暴露于空气后，空气中的CO₂进入后形成CaCO₃会产生沉淀，从而减少游离的Ca²⁺，导致实验的结果不佳。

9、污染其他的缓冲液。如吸取PBS 后不更换Tip头会导致游离的Ca²⁺的减少，从而导致实验的结果不佳。

10、阳性细胞的丢失。如果是贴壁细胞，药物诱导后漂浮的细胞要收集起来合并检测，这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞，丢弃会造成阳性结果偏低。

11、在一些自噬细胞样本中，PS外翻可能受阻，此时Annexin V不适合用于早期凋亡检测。

● 实验过程中阳性率偏高。可能的原因如下：

1、用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。

2、细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。

若活力偏低低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3次以后才能进行实验。

3、细胞操作不当。贴壁细胞消化过程中反复剧烈吹打导致细胞膜破坏，使得假阳性偏高。细胞洗涤、重悬等过程过于剧烈导致细胞膜损伤。Annexin V-FITC会进入损伤的细胞膜，在细胞膜内部染色。

4、凋亡诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上，诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。

5、固定液可导致凋亡假性增多，所以切勿固定。

6、受污染的细胞。检查细胞是否有细菌/酵母/支原体污染。

● 凋亡细胞染色后流式检测时细胞整体右移？

经过刺激之后，细胞通常会发生一些物理性质如体积或代谢物质的改变，导致细胞右移，是一种常见的现象。需要把门往右移。

● 如何确定细胞早期凋亡的时间点，找到正好的合理的百分比？

得到合理的百分比的时间可以利用简单的DAPI染色或者Hochest染色，观察加药时间的时间点上细胞核的状态变化，准确判断细胞早期凋亡发生的时间点。

如果您觉得“HR0399 Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒”描述资料不够齐全，请联系我们获取详细资料。(联系时请告诉我从给览网看到的，我们将给您最大优惠！)
本页链接：http://www.geilan.com/com_bjbiolab/sell/itemid-9455501.html
已经有854位访客查看了本页.