YT357 细胞内pH荧光探针

细胞内pH荧光探针(BCECF AM)是高品质的探针标记及检测产品，由北京百奥莱博供应，本产品仅用于生物化学研究方面，本产品质量好，且具价格，深为用户称道，了解更多细胞内pH荧光探针(BCECF AM)等探针标记及检测产品请联系我司咨询订购。...

特别提示：包括细胞内pH荧光探针(BCECF AM)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：细胞内pH荧光探针(BCECF AM)
英文名称：Intracellular pH fluorescence probe
产品货号：YT357
产品规格：50微升

本品是zuì常用的检测细胞内pH的荧光探针，用于细胞内pH检测时，常用的BCECF AM的浓度为1-10μM。本BCECF AM(pH荧光探针)是配制于无水DMSO(anhydrous DMSO)中的储存液，浓度为5mM。

BCECF AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。BCECF AM没有荧光，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成BCECF，从而被滞留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。zuì大激发波长和发射波长因pH的不同而有所不同，zuì大激发波长大致在503nm左右，zuì大发射波长大致在520nm左右，实际检测时推荐使用的激发波长为488nm，发射波长为535nm。BCECF在不同pH条件下的发射光谱参考下图。



BCECF AM不仅被广泛用于哺乳动物细胞的研究，也有报道用于动物组织、植物细胞、细菌和酵母等的细胞内pH水平检测。在有细胞内pH变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中BCECF AM被广泛应用。

注意事项：
1. BCECF AM(pH荧光探针, 5mM)可能对人体有害，请注意适当防护。
2. 本BCECF AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
3. 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

储存条件：-20℃，有效期12个月。

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名称：PCR法DNA探针标记试剂盒
货号：BTN90604A
规格：5次
PCR标记的原理是用带标记的dNTP进行PCR，zuì后得到的PCR产物将带有标记，可以直接用于杂交试验。其原理示意图如下：


产品特点：
1.一站式，本试剂盒提供经过优化的试剂，不需要用户自己摸索。
2. 足够10次50μl体系的常规PCR(用于制备标记反应的模板和设置对照反应)和5次50μl体系的标记反应。
3.一次标记可以得到μg级的双链DNA探针或约700ng的单链DNA探针，足够多次杂交实验用。
4. 既可用于制备双链探针，也可以用于单链探针。
5. 90604A需自备含标记核苷酸的dNTP，90604B和90604C分别含生物素和地gāo辛标记的底物。自备的标记包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本产品得到的探针参入率一般为4-5%(每100个核苷酸中有4-5个将带有非同位素标记)，有效降低了空间阻碍，检测效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等分析。

试剂盒组成：

成分	规格
2×标记专用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(仅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(仅C有)
超纯水	1ml
说明书	1份

注：标记专用PCR Mix不含dNTP。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：准备工作
1. 按常规的方法设计PCR引物，使探针长度在400-800bp之间。过短则标记参入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
2. 根据PCR引物优化PCR条件。
3. 由于标记的dNTP比较珍贵，所以本试剂盒不推荐以基因组DNA或其他复杂DNA为模板直接进行PCR标记，而是建议采取下述的两步法标记来提高成功率，即先制备非标记PCR产物，再以之为模板制备标记的PCR产物。
二：非标记PCR产物的制备
4. 设置50μL PCR的反应体系：

成份	用量
2×标记专用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自备的探针引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自备的探针引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自备的模板DNA	1μg基因组DNA或1ng质粒DNA
超纯水	补到50μL

5. 按已经优化的PCR参数进行PCR。
6.电泳检测和胶回收所需的PCR产物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR产物(具体取决于PCR产物的长度)。注意：zuì好采取胶回收而不是PCR回收以避免残留引物干扰后续的标记PCR。
三：标记PCR反应(zuì好做一个不加标记的对照用于定量)
说明：在设置下面反应时，如果加一种引物，就得到单链标记的PCR产物；如果加两种引物，则得到双链标记的PCR产物。由于双链PCR探针在杂交前虽然要变性成单链后使用，但杂交时变性的双链彼此还会复性，这种复性会与探针-靶DNA杂交反应相竞争，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记的DNA探针。

成份	样品	对照
2×标记专用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自备的含其他标记dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
双链标记：探针引物一和引物二 单链标记：探针引物一或引物二	每种50 pmol 一种50 pmol	每种50 pmol 一种50 pmol
上步胶纯化所得PCR产物 (单链标记可用100ng)	10 ng	10 ng
超纯水	补到50μL	补到50μL

 注意：本试剂盒提供的dNTP混合物中，标记底物与非标记底物的比例已经进过优化，如果自备标记dUTP，其与dTTP的zuì佳比例需要优化，标记不同，比例不同。对DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；对BrdUTP，zuì佳比例为1：1。
7. 按第5步的PCR参数进行标记PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到35-55个循环。由于模板为纯化后的PCR产物，探针对扩增长度完整性要求不高(长度不均的探针由于能形成网络结构，效果反而更好)，所以可以增加循环数；二是延伸时间增加15秒，因为标记dUTP参入到DNA的速度比常规的dTTP慢；三是降低复性温度5-7℃，因为标记核苷酸参入到DNA后，新模板的Tm值将降低。
8. 标记探针的定量：取标记反应和对照反应的产物1-5μl，在琼脂糖凝胶上跟浓度已知的DNA marker一起电泳，并判断探针的浓度。由于标记反应的PCR产物中额外带有非同位素的配体(生物素，地gāo辛等)、因此其泳动速度将慢于非标记PCR产物(但同位素标记不能用此法)。
 注意：如果扩增的是单链DNA探针，其结合EB的能力远低于双链DNA(EB是嵌合到双链碱基对之间的，而单链DNA没有碱基对，只有一些局部区域折叠形成的有限双链区，因此能结合的EB很少)，因此EB染色的强弱不能准确反应DNA的浓度，可以采用银染定量(跟marker比较)。一般100ng模板按上述条件经过单链PCR扩增可得到700ng左右探针。
9. 剩余的PCR标记产物可以不经过纯化，直接加入(对单链PCR探针)杂或加热变性并急冷后加入(对双链PCR探针)到杂交液中使用。如果暂时不用请放-20℃长期保存。如果需要纯化，请使用乙酸铵/乙醇沉淀法。

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货号	名称	规格
BTN130997	Sephadex G50介质	10mL
BTN90605C	TdT加尾法DNA地gāo辛标记试剂盒	5次
BTN100921	地gāo辛标记dUTP溶液(Digoxin-11-dUTP)	25μL
BTN90603A	随机引物法DNA探针标记试剂盒	5次
BTN90603B	随机引物法DNA探针生物素标记试剂盒	5次
BTN8091	超级杂交液(不含甲酰胺)	100mL
BTN130906	超级杂交液(原位杂交)	10mL

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