HR9110 酵母内质网提取试剂盒(低速离心法)

酵母内质网提取试剂盒（低速离心法）只需要达到20000×g以内的离心力即可提取内质网，一般的常规台式离心机均可以满足使用要求。酵母内质网提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种酵母样品中提取总内质网。提取过程简单方便。本试剂盒不能用于冷冻样品的内质网提取。...

酵母内质网提取试剂盒(低速离心法)

 

产品编号：HR9110

产品组成：

储存条件：

2-8℃保存，有效期1年。

【注】：

● 酵母内质网提取液B、酵母洗涤液D长期不用时-20℃保存。避免反复冻融。

产品简介：

传统的内质网提取方法需要采用较高的离心力或者采用密度梯度离心，对实验室离心机设备要求较高，对实验的操作细致程度要求较高。如果实验室没有能达到50000×g以上的离心力的设备，则没法进行提取。

酵母内质网提取试剂盒（低速离心法）只需要达到20000×g以内的离心力即可提取内质网，一般的常规台式离心机均可以满足使用要求。

酵母内质网提取试剂盒提供全套试剂，适用于从各种酵母样品中提取总内质网。提取过程简单方便。

本试剂盒不能用于冷冻样品的内质网提取。

酵母内质网提取试剂盒(低速离心法)试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：

● 离心机 ● 振荡器 ● 移液器 ● 匀浆机/匀浆器 ● 涡旋混匀器 ● PBS ● 蛋白定量试剂盒

使用注意事项：

● 预实验很重要。必须要做预实验，在正式实验之前取少量样本优化实验条件，并像正式样本一样认真进行，看实验结果是否可行，实验条件是否适合自己的样本。由于生物样本的多样性，不同样本的实验条件通常差异较大，同种细胞的不同模型下需要的实验条件也可能不同，为了避免浪费正式样本和试剂，一定要提前预实验优化实验条件。

● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

● 如果是做核酸类下游应用，实验中所有液体以及器具均应该用DEPC 处理。用0.1%的DEPC处理12小时然后高压。

● 下游用于蛋白质类实验的话可以不用DEPC处理。

● 细胞最好采用新鲜收集的，或者收集后立即置于-80℃保存的样本。

● 最好使用标准Dounce匀浆器匀浆，如果没有标准Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是内质网回收率可能会下降。

● 离心机转速有相对离心力（RCF，×g）和每分钟转速（RPM，r/min）两种表示方式，有些离心机设置有RPM和×g显示切换，但部分离心机没有自动切换功能。需要用下面的公式进行换算：

g=r×1.118×10^-5×rpm²（r为有效离心半径，即从离心机轴心到离心收集管底部中心位置的长度，单位为厘米) 例如：转速为3000rpm，有效离心半径为10cm，则相对离心力（RCF，×g）为=10×1.118×10^-5×3000²=1006.2（×g）。

使用方法：

1、酵母培养物，在4℃，1000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。

2、用PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

【注】：

● 在1000×g离心5 分钟。

3、每100μL体积或100 mg 湿重酵母沉淀物中加入400μL酵母内质网提取液A，混匀后，在30℃条件下保温15分钟。

【注】：

● 酵母数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。

4、在1000×g条件下离心5-10分钟，收集酵母沉淀。

5、用300μL酵母洗涤液D重悬细胞，静置10分钟，离心收集酵母。

6、酵母沉淀物中加入500μL酵母内质网提取液B，充分混匀。

【注】：

● 根据酵母细胞量调整提取液用量，一般加菌体体积的2-5倍均可。

● 按酵母菌体体积每100μL或100mg湿重菌体加入250-500μL提取液。

7、在37℃或室温条件下轻微振荡60-90分钟。

【注】：

● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。

● 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔10分钟用移液器吹打混匀。

● 不同酵母样本需要的时间差异较大，根据下游细胞裂解的难易程度调整，如果下游试剂C处理后沉淀没有明显减少，需要延长此步骤处理时间。可以延长至2小时。

8、在2000×g条件下离心5-10分钟，弃上清，收集沉淀。

9、沉淀用300μL酵母洗涤液D洗涤两次。离心收集沉淀。

10、在沉淀中加入400μL酵母内质网提取液C，充分混匀，用Dounce匀浆器匀浆20-30下。

【注】：

● 标准Dounce匀浆器用紧杵5-8次，松杵匀浆15-20次。

● 匀浆杵一个上下来回为一次。

● 普通玻璃匀浆器匀浆一般也不超过30次，匀浆次数并非越多越好。

● 如果没有匀浆器，可以在加入试剂C以后在振荡器上振荡10-30分钟。用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液有轻微晃动即可。没有振荡器的话，在4℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。

● 试剂C处理后沉淀应减少，否则振荡延长处理时间。

11、将匀浆液在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。

12、将上清在4℃，3000×g力条件下离心10分钟，弃沉淀，收集上清。

13、将上清在4℃，12000×g-20000×g力条件下离心10分钟。弃沉淀，收集上清。

14、在上清中加入100μL试剂E，充分混匀。

15、置2-8℃冰箱静置过夜。

【注】：

● 静置保存时间不少于10小时。

16、在4℃条件下，10000×g离心20-45分钟。

17、小心移除上清，收集沉淀。

【注】：

● 尽可能吸干上清。

● 吸取时小心，防止吸掉沉淀。

18、沉淀用适量内质网保存液或其他相应的缓冲液重悬。即得到酵母内质网样品。

【注】：

● 也可不用试剂盒中内质网保存液重悬，据实验需要选择合适的缓冲液重悬内质网或直接用于下游实验。

19、置冰箱备用或直接用于下游实验。酵母内质网提取试剂盒(低速离心法)

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