WH0126 lncRNA cDNA链合成

lncRNA cDNA链合成是高品质的基因结构和功能产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于科研试验，本产品质量好，且具价格，深为用户称道，了解更多lncRNA cDNA链合成等基因结构和功能产品请联系我司咨询订购。...

特别提示：包括lncRNA cDNA链合成试剂盒（去除基因组DNA)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：lncRNA cDNA链合成试剂盒（去除基因组DNA)
英文名称：lncRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit （With gDNase)
产品货号：WH0126
产品规格：20μl×25次|20μl×100次

本试剂盒是专门针对长链非编码RNA （lncRNA)反转录而开发的产品。与mRNA相比，lncRNA具有丰度低、GC含量差异大、二级结构更复杂等特性，传统反转录试剂对lncRNA难以达到理想的效果。本试剂盒含有去除基因组DNA的gDNase，通过42℃，3min即可去除RNA样品中残留的基因组DNA，可有效避免残留的基因组DNA对后续PCR检测结果的干扰。本试剂盒中lnR RT Enzyme Mix中使用的反转录酶为QuickKing RT Enzyme，此酶是通过分子改造后的反转录酶，特别增加了疏水motif，具有更强的RNA亲和性和热稳定性，从而进一步提高了其反转录效率和反应速率，42℃、15 min即可完成cDNA链的合成，且反转录长度至少可达10 kb。另外，酶与RNA亲和力的更强，配合特殊优化过的缓冲体系和引物体系，使本试剂盒在通读GC含量高，二级结构复杂，低丰度的RNA模板和抗逆性等方面表现突出，特别适合表达水平相对较低，二级结果相对复杂的lncRNA的反转录反应。

产品特点：
·性能：反转录效率可达95%以上，Total RNAzuì低检测下限可达10ng，反转录长度可达10 kb以上。
·简单快速：反应体系配制简单，21 min完成lncRNA cDNA链的合成；
·适用广泛：能够通用于GC含量差异大，二级结构复杂，低丰度的RNA模板；对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高；
·兼容性好：后续配合荧光定量检测产品，灵敏度高、稳定性好。

试剂盒组成：

组分	25次	100次
5×gDNA Buffer	50μl	200 μl
lnR-RT Primer Mix	50μl	200 μl
lnR RT Enzyme Mix	25 μl	100 μl
10×lnR RT Buffer	50μl	200 μl
RNase-Free ddH2O	1ml	2×1ml

储存条件：-20℃可保存一年。

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。）
1．下列操作步骤适用于模板量为10ng-2μg的Total RNA，如果Total RNA量大于2μg，请按比例扩大反应体系。
2．在冰上进行操作，防止RNA发生降解。
3．对于二级结构很复杂的RNA模板，推荐使用变性步骤，即在操作步骤之前，将模板RNA在65℃孵育5 min后迅速转移到冰上，然后再进行下一步操作。
4．根据实验需求不同，也可以选用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，引物使用量：
  Oligo-dT Primer 50pmol/20 μl反应体系，
  Gene Specific Primer 5pmol/20 μl反应体系。
5．当PCR反应有非特异性扩增时，将反转录温度升到50℃会有改善。

对RNA模板的要求：
反转录酶以RNA为模板合成链cDNA，模板RNA的质量和数量直接影响反转录的结果。

1．模板的完整性：模板RNA的完整性对反转录非常重要，若RNA模板中含有RNase酶将降解模板RNA，zuì后导致cDNA产物的量少甚至无cDNA产物。
2．模板的纯度：若RNA模板中含有蛋白、盐离子、EDTA、乙醇、酚等杂质，将影响反转录酶的活性，zuì后影响反转录结果。
3．模板的加量：上述操作步骤适用于模板RNA量为10ng-2μg，如果模板RNA的量大于2μg，请按比例扩大反应体系。

操作步骤：
10ng-2μg Total RNA可建立20 μl反应体系，具体过程如下所示：

1．将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、lnR-RT Primer Mix、10×lnR RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
  注意：以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
2．按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
表1：gDNA去除反应体系

组分	用量	终浓度
Total RNA	10ng-2μg
5×gDNA Buffer	2 μl	1×
RNase-Free ddH2O	补至10μl

3．按照表2的反转录反应体系配制混合液。
表2：反转录反应体系

组分	用量	终浓度
10×lnR RT Buffer	2 μl	2×
lnR RT Enzyme Mix	1 μl	-
lnR-RT Primer Mix	2 μl	-
RNase-Free ddH2O	补足到10 μl	-

4．将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀后即完成20 μl反应体系。
5．42℃，孵育15 min。
6．95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。

注意：
1．若后续实验为实时荧光定量PCR，反转录产物的加量应不超过PCR体系终体积的1/10，例如50μl的PCR反应体系，反转录产物的加量应不超过5 μl。
2．反转录结束后，请将反转录产物置于冰上，再进行后续PCR反应配制；如果需要长时间保存，请置于-20℃。

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名称：Amelogenin/MAME mRNA原位杂交试剂盒
货号：ZN0054
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：mouse
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.Amelogenin/MAME mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗dì高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗dì高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
Amelogenin/MAME的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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