WH0131 miRNA cDNA链合成试

miRNA cDNA链合成试是高品质的基因结构和功能产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于科研目的，本品质量稳定，价位合理，需要miRNA cDNA链合成试等基因结构和功能产品的客户，请到我公司官网联系我们。...

特别提示：包括miRNA cDNA链合成试剂盒（加A尾法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：miRNA cDNA链合成试剂盒（加A尾法)
英文名称：miRNA First-Strand cDNA Kit
产品货号：WH0131
产品规格：20μl×25次|20μl×50次

本试剂盒采用加A法来进行miRNA链cDNA的反转录。具体过程是先通过E.coli Poly（A) Polymerase在miRNA 3′末端加多聚A尾Poly（A)，再使用Oligo（dT)-Universal Tag通用逆转录引物进行逆转录反应，zuì终生成miRNA对应的cDNA链。

本试剂盒采用了双组分形式，简化了实验操作流程，降低了操作失误的可能性。本产品中的miRNA RT Enzyme Mix包含了E.coli Poly（A)Polymerase、RTase和RNasin。其中的E.coli Poly（A) Polymerase不但具有的加A尾效率，还可特异性识别单链miRNA，从而避免了具有双链结构的miRNA前体的进一步逆转录反应；RTase经过分子改造，去掉了RNase H活性，增加了RNA模板亲和力，从而使得miRNA的逆转录反应具有更高的效率和灵敏度。

本试剂盒中的2×miRNA RT Reaction Buffer包含了miRNA加A尾反应和逆转录反应的所有原料和引物，并经过精心优化，可保证miRNA 3′末端的Poly（A)修饰过程和逆转录过程同时进行。

本试剂盒须与miRNA荧光定量检测试剂盒（WH0132)配套使用。

产品特点：
·省时省力：本试剂盒将miRAN的加A尾反应和逆转录反应合二为一，在减少操作步骤的同时也节省了一半的反应时间。另外，本试剂盒为双组分形式，操作过程中只需加入RNA模板和两个组分即可进行miRNA的逆转录反应，进一步简化了操作。
·特异性强：本试剂盒中的E.coli Poly（A) Polymerase和RTase都只针对单链的miRNA进行修饰和逆转录反应，因此可zuì大程度的避免具有二级结构的miRNA前体进行逆转录反应。
·灵敏度高：本试剂盒通过将加A尾反应和逆转录反应的整合实现了miRNA的加A产物可全部进行进一步的逆转录反应，大大提高了低丰度miRNA的检出率。
·适用广泛：本试剂盒可针对几乎所有材料提取的miRNA进行逆转录反应，模板的使用范围可达20pg~2μg（质量范围)和10 fM~100 pM （浓度范围)。

试剂盒组成：

组分	20μl×25次	20μl×50次
miRNA RT Enzyme Mix	50μl	100 μl
2×miRNA RT Reaction Buffer	250μl	500 μl
RNase-Free ddH2O	1ml	1ml

储存条件：-20℃下可保存1年。收到本产品后，请立即置于-20℃下保存。从-20℃取出使用时，将miRNA RT EnzymeMix需放在冰中备用；将冻存的2×miRNA RT Reaction Buffer融解，融解后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。

预防RNase污染，应注意以下几方面：
1．经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2．使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3．RNA在裂解液中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4．配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1% （v/v)，放置过夜，高压灭菌)。

操作步骤：
一、反转录体系的配制
解冻2×miRNA RT Reaction Buffer并混匀，miRNA RT Enzyme Mix放于冰中备用，在冰上预冷RNase Free的反应管内加入以下试剂至总体积20 μl （zuì后加入miRNA RT Enzyme Mix)。

组分	使用量	终浓度
Total RNA*	可达2μg	-
2×miRNA RT Reaction Buffer	10 μl	1×
miRNA RT Enzyme Mix	2 μl	-
RNase-Free ddH2O	补至20 μl	-

*反应中所使用的Total RNA必须含有小分子RNA。此过程也可以使用小分子RNA作为模板，建议加入量为2-5 μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA样品而言（如血清血浆提取物)，可直接加入zuì大体积8 μl。

二、反转录程序
移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行miRNA的逆转录反应：

反应温度	反应时间	说明
42℃	60 min	miRNA加A尾反应和逆转录反应
95℃	3 min	酶失活反应

合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存；也可以直接进行下游荧光定量检测。在进行下游荧光定量检测时，为避免逆转录体系对定量PCR反应的抑制，得到zuì适的Ct值（15-30之间)，可将cDNA反应液稀释10-1000倍后使用。

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货号	名称	规格
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名称：小鼠基因组DNA
货号：BTN131033
规格：100μg
本产品为小鼠基因组DNA，是从无疾病小鼠全血中分离到的。利用脉冲电场凝胶电泳测量，90%以上的DNA的大小大于50kb。该DNA适用于Southern blot杂交,基因组分析(包括 PCR)及基因组文库构建等实验。

储存条件：低温运输、4℃保存、有效期一年。

名称：ADRβ1 mRNA原位杂交试剂盒
货号：ZN0037
规格：100T
基本信息：
保存条件：4℃保存一年
工作量：100张切片。
有效期：一年。
适用种属：rat
标记方式：3’—尾段标记
试剂盒中内容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.预杂交液 2ml；
3.ADRβ1 mRNA原位杂交试剂盒寡核苷酸探针杂交液 2ml；
4.封闭液 5ml；
5.生物素化鼠抗dì高辛 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂：
原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位杂交用 PBS)
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7•H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3•2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4•12H2O 6g,NaH2PO4•2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
8．杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9．杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
11.滴加生物素化鼠抗dì高辛：37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染，充分水洗。
16.酒精脱水，二甲苯透明，封片。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察：
ADRβ1的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：
由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照，基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时，用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—10倍；并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

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