BTN160684K 零背景平末端克隆试剂盒

零背景平末端克隆试剂盒是高品质的克隆与表达产品，由北京百奥莱博供应，本产品仅用于生物化学研究方面，本产品质量好，且具价格，深为用户称道，了解更多零背景平末端克隆试剂盒等克隆与表达产品请联系我司咨询订购。...

特别提示：包括零背景平末端克隆试剂盒(Kan抗性)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：零背景平末端克隆试剂盒(Kan抗性)
英文名称：Blunt Cloning Kit(Resistance to Kanamycin)
产品货号：BTN160684K
产品规格：25次

本产品是基于Topoisomerase能够在几秒钟之内高速连接DNA片段的原理开发的无背景克隆试剂盒，它使用了本公司通过定点突变改良的TOPO酶，连接效率比野生型更高。

产品特点：
1. 快速，连接反应几乎在几秒钟内完成，连接率几乎达到。
2. 适用于pfu、KOD等高保真聚合酶扩增的平末端片段的克隆。
3. 无杂带或引物二聚体的PCR扩增产物可以不经过纯化直接用于连接反应。
4. 零背景，无需IPTG-X-Gal蓝白斑筛选，故不需要IPTG-X-Gal培养基。
5. 本试剂盒按10μl标准反应体系。
6. 提供含Amp和Kan两种抗性的载体供选择（BTN160684A是含Amp抗性TOPO载体，BTN60684K是含Kan抗性TOPO载体）。

产品组成：

组分	编号	规格
TOPO-Kan Blunt载体	BTN160684K	25μl
连接缓冲液	BTN160684B	25μl
M13F引物		50uL
M13R引物		50uL
超纯水	BTN100935	1mL

保存条件：-20℃，有效期一年。

自备试剂：DNA插入片段、感受态细胞、SOC或LB培养基和培养皿（含抗菌素和不含的）

使用方法：
1. 如果是PCR制备插入片段，所用引物不能磷酸化，使用pfu、KOD等产生平末端片段的高保真DNA聚合酶。为保证扩增产物的完整性，PCR循环结束后，再延伸5-10分钟，确保片段延伸完全。
2. 电泳检测并相对定量PCR片段（跟DNA marker比较）。根据插入片段长度和下表确定每次连接反应需要的zuì佳用量：

插入片段长度	zuì佳用量
100-1000bp	20-50ng
1000-2000bp	50-100ng
2000-5000bp	100-200ng

3. 在一个干净的塑料离心管中，室温下（不要放在冰上）设置如下连接反应体系：

加入物	加入量
纯化后的PCR产物	不超过8μl
TOPO-Kan Blunt载体	1uL
连接缓冲液	1uL
超纯水	补到10uL

  注意：如果使用未经纯化的PCR产物，则需要加入量不能超过1μl，否则PCR体系会干扰连接体系。
4. 轻柔吹打混匀后，短暂离心，常温（20-30℃）放置0-5分钟。如果在冬天室温低于20℃，建议使用25℃水浴或金属浴。
  注意：连接时间超过5分钟的话连接效率会降低。
5. 如果当天不转化，可以将离心管放-20℃保存。如果转化，则取5μl连接液加到50-100μl刚刚融化的感受态细胞中，轻柔混匀。
  注意：本产品要求感受态细胞的转化效率不得低于5×10E7cfu/ug。
6. 如果片段长度小于2 Kb，则不需要冰浴和热激，直接在离心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培养基，然后取200μl涂盘。也可以先3000g离心2分钟后，弃掉大部分上清，只留约100μl左右，然后重悬细菌后全部涂盘在含Kan的培养皿上，37℃过夜培养。
7. 如果片段长度长于2 Kb，则按常规转化方式，先冰浴2-30分钟，然后42℃热激30秒，冰上防放置2分钟，再在离心管中加入500μl不含抗菌素的SOC或LB培养基，37℃ 250rpm培养60分钟，然后取200μl涂盘。也可以先3000g离心2分钟后，弃掉大部分上清，只留约100μl左右，然后重悬细菌后全部涂盘在含Kan的培养皿上，37℃过夜培养。
8. 用M13F/M13R通用引物进行菌落PCR或直接测序来鉴定重组子。

该载体的多克隆位点序列：


通用测序引物序列：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

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