JN0052 两步法RT-qPCR试剂盒
- 产品/服务：JN0052 两步法RT-qPCR试剂盒
- 型 号：JN0052
- 品 牌：百奥莱博
- 单 价：面议
- 更新日期：2023-05-31
- 有效期至：长期有效
- 浏览次数：1012
产品简介
我公司致力于为客户提供高纯度、低成本的活性重组蛋白，包括两步法RT-qPCR试剂盒在内的各类受体、细胞因子、生长因子、转录因子、激素、酶、毒性蛋白、病毒抗原等。...
产品详细介绍
特别提示：包括两步法RT-qPCR试剂盒(SYBR)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
产品名称：两步法RT-qPCR试剂盒(SYBR)
英文名称：SYBR Two-Step qRT-PCR UltraMix
产品货号：JN0052
产品规格： 50次RT+300次qPCR
本试剂盒能以动物、植物和微生物的总RNA或mRNA为模板，用Balbs
本制品配有不同浓度的ROX Reference Dye，用于不同仪器校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。
操作方法：
一、链cDNA合成
融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
1、按顺序加入下面的反应物
| 加入物 | 加入量 |
| 模板RNA |
总RNA(0.1 ng -5μg) poly(A) mRNA(10 pg) 特异性RNA(0.01 pg) |
| PreMix 1st Strand cDNA Synthesis UltraMix | 10μl |
| RNase Free Water | 至20μl |
2、可选优化步骤。如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将模板和引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5分钟，冰上冷却。
3、轻柔混匀后离心。如果RNA模板中不含poly A结构，25℃先孵育5分钟，随后42℃孵育60分钟。
4、70℃加热5min终止反应。
反应产物可直接用于PCR反应，如果不立即使用，在-20℃可保存一周左右。如想延长保存时间，建议使用-70℃保存。
二、实时定量
合成的链cDNA可直接用于PCR或qPCR。链cDNA反应液体积不能超过PCR反应体系的1/10。通常50 μl的PCR反应体系中，链cDNA反应液加入2μl。
·用ROX Reference Dye I校准的Real Time PCR仪有：
Applied Biosystems 5700/7000/7300/7700/7900/7900 HT/7900 HT Fast；Applied Biosystems StepOne/StepOne Plus；其他仪器。
·用ROX Reference Dye II校准的Real Time PCR仪有：
Applied Biosystems 7500/7500 Fast；Stratagene MX4000/MX3500P/MX3000P；其他仪器。
·不需要用ROX Reference Dye校准的Real Time PCR仪有：
Bio-Rad CFX96/CFX 384/iCycler iQ5/ iQ /My iQ5/MiniOpticon/Opticon/Opticon /Chromo4；Eppendorf MasterCycler realplex/ realplex 2s。Cepheid SmartCycler；Illumina Eco qPCR；R℃he Applied Science LightCycler 480；Thermo Scientific PikoReal Cycler；Qiagen/Corbett Rotor-Gene Q/Rotor-Gene 3000/ Rotor-Gene 6000；其他仪器。
注意事项：
1、用DEPC处理实验用到的所有器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，整个实验过程需戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
2、确保所用试剂中无RNA酶污染。
3、试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管盖要确保扣严。
4、纯化过的RNA要保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀法去除痕量污染物。
储存条件：-20℃
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名称：5M甜菜碱溶液，PCR级
货号：BTN70902
规格：1.5mL
本产品为浓度为5M的甜菜碱的水溶液，可以直接加入到PCR反应或测序反应中提高扩增或测序的效率，其详细的用途包括：
1. 降低富含GC的模板形成二级结构的可能,有助于富含GC的模板的PCR扩增和测序。
2. 降低变性温度对碱基的依赖性。
3. 提高LA-PCR的扩增效率。
4. 提高Taq DNA聚合酶的稳定性。
储存条件：低温运输，4℃保存，有效期一年。
使用方法：将本产品加入PCR反应体系中，使其终浓度在1.0-1.7M之间即可。其他按常规操作进行即可。
名称：可调式易错PCR试剂盒
货号：BTN160903
规格：100次
易错PCR是利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的特性，在一定条件下(如不同的dNTP浓度、Mg浓度和MnCl2存在)能够按较高的机率引入随机引入突变。如果有适当的选择方法，则可从构建的突变库选出所需突变体。易错PCR和常规PCR的比较如下：
产品特点：
1. 即开即用，十分简单方便，尤其在生物制药和酶学研究领域显示出了它的优越性。
2. 配方经过精心优化，实验人员在一定范围内可以控制突变率，一轮PCR的突变率范围在2-8突变/1000bp，更高的突变率可以通过多轮PCR达到。
3.可用于连续易错PCR，只需把上一次易错PCR的产物用作下一次易错PCR的模板即可，使每一次获得的小突变累积而产生重要的有益突变。
4.可以扩增的DNA片段更长，达到3kb，对于3kb以上的产物，建议分段扩增。
试剂盒组成：
| 成分 | 规格 |
| Taq DNA聚合酶(5U/μL) | 100μl |
| 易错PCR专用dNTP 2.0,10× | 300μl |
| 易错PCR Mix 2.0,10× | 300μl |
| 易错PCR专用MnCl2 | 300μl |
| 易错PCR专用dGTP | 300μl |
| 超纯水 | 1ml |
储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期为一年。
使用方法：
1. 将模板DNA稀释到1ng/uL。将引物稀释到10uM。
注意：引物是决定易错PCR成败的关键因素，设计引物时要保证其Tm在70℃，长度在25-30nt之间，GC含量在45%-60%之间，3端GC含量低，并且没有发夹结构。
2. 根据每1000bp的预期突变数按下表确定易错PCR的反应条件中MnCl2和dGTP的用量。表中的A表示易错PCR专用的MnCl2，B表示易错PCR专用的dGTP：
| 预期突变数 | 2个 | 3个 | 4个 | 5个 | 6个 | 7个 | 8个 |
| A的用量(μl) | 0 | 1.0 | 2.5 | 4.0 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
| B的用量(μl) | 0 | 0 | 0 | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 |
3.以30μL的标准PCR反应体系为例，如果反应体系不是30μL，各成分需要按等比例增加或减少。在一干净的PCR管中，加入下列成分
注意：可以先计算出超纯水的用量，优先加水
| 成分 | 用量 |
| 超纯水 | 根据第2步加 |
| 易错PCR Mix,10× | 3μl |
| 易错PCR 专用dNTP，10× | 3μl |
| 易错PCR 专用MnCl2 | 根据上步 |
| 易错PCR 专用dGTP | 根据上步 |
| 自备DNA模板(1ng/μl) | 1μl |
| 自备PCR引物(10μM each) | 1μl each |
| Taq DNA聚合酶(5U/μl) | 1μl |
4. 按已经优化的PCR条件进行一定循环数的PCR(循环数与突变率的关系见下表)，然后取5μL电泳检查。如果没有优化的PCR条件，一般可以先尝试下面的PCR条件(对1Kb长的模板而言)：
| PCR前变性 | 94℃ 3分钟 |
| 易错PCR(循环30次) | 94℃ 1分钟 |
| 45℃ 1分钟 | |
| 72℃ 1分钟 |
注：易错PCR一般不需要热启动，也不需要在PCR结束后做延伸处理。长度每增
加1Kb，时间延长1分钟。易错PCR循环次数决定每个核苷酸位置的突变几率，进而决定每个PCR产物可能的突变位点数，所以所需循环数由客户根据需要改动。
5.电泳检测是否得到预计长度的PCR产物。
6. 克隆片段进行功能筛选、或者克隆后进行测序分析突变率、或者用此轮PCR的产物为模板，进行下一轮的易错PCR。
疑难解答：
Q：现象：没有PCR产物。
A：可能原因：一是引物没有优化，可以重新设计引物；二是模板DNA太少，可以增加用量；三是模板不纯，zuì好先胶回收；四是溶解DNA的溶液中有EDTA，降低了PCR反应体系的Mg离子浓度，可以适当补加Mg离子。
Q：现象：太多的PCR条带或PCR条带模糊一片。
A：可能原因：一是PCR循环数太多；二是复性温度太低；三是延伸时间太长；四是引物没有优化，可以重新设计引物；五是PCR条件没优化，可以使用touch-down PCR；六是模板有其他DNA污染；七是DNA模板质量不高或者浓度太高。
Q：如果需要更高的突变率，如何办？
A：可以使用连续多次易错PCR来提高突变率。但zuì好先用胶纯化回收PCR片段,再用于下一轮易错PCR。此外不能用少于千分之一的次PCR产物作为第二轮易错PCR的模板，否则多样性将受到影响。第三轮易错PCRzuì好使用所有第二轮的PCR产物作为模板，但需要在10mL体系中完成(可以分成很多100μL体系进行)。
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