MT0081 His标签蛋白纯化树脂

His标签蛋白纯化树脂由北京百奥莱博供货并提供相关技术服务支持，本品仅用于生物化学研究方面，我公司专注于蛋白质研究产品的研发、生产和供应，为您提供的His标签蛋白纯化树脂质量可靠，批间差小，且价格公道，热切盼望您选购我们的产品。...

特别提示：包括His标签蛋白纯化树脂在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：His标签蛋白纯化树脂
英文名称：Ni-NTA Resin
产品货号：MT0081
产品规格：20ml

本制品是用于纯化6xHis标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由4%交联的Sepharose耦连了一种四齿螯合剂NTA而得. Ni-NTA树脂用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的6×His标签重组蛋白。NTA，含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+。6×His可与Ni2+螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低PH缓冲液被温和的洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白。



产品特点：
1．该纯化介质与His标签蛋白具有高的亲和力，可达5～20mg/ml。
2．可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His标签蛋白。
3．纯化程序简单，所得的蛋白纯度可高达95％。
4．Ni-NTA Resin可再生4～6次，重复使用。

产品应用：
1．His标签蛋白的纯化。
2．蛋白结构与功能研究。
3．蛋白-蛋白以及蛋白-DNA之间相互作用的研究。
4．配体-受体之间相互作用的研究。

应用实例：

PET28a系统于BL21(DE3)中诱导表达蛋白。M:中分子量蛋白Marker（MT0073），泳道1-5分别为：未诱导全菌蛋白，加IPTG诱导全菌蛋白，过柱液，洗涤液，洗脱液。

保存条件：4℃保存，切勿冻存。

操作方法：

A．非变性条件下抽提His标签蛋白：

1. 样品准备：
1) 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET 载体表达系列，在细胞OD600=0.5～0.8时，用1mM IPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70℃或立即进行步骤2操作。
2) 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer（20mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl,10% Glycerol)和 1mM PMSF。
  注意：PMSF 见水分解，需要在使用前加入。
3) 将细胞悬浮起来，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操作。
4) 加入10% Triton X-100, 使终浓度为 0.05%，充分混匀，冰上放置15分钟。
5) 13000转/分(20000g以上)，4℃离心15分钟。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

2．层析：
1) 将 NTA 树脂装入合适的层析柱，层析用10 倍 NTA 体积的NTA-0 Buffer 平衡填料。
2) 将上清样品加至 NTA 层析柱中，流速在15ml/h 左右，收集穿透部分，用于 SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。
3) 层析用5 倍 NTA 体积的NTA-0 Buffer 洗涤填料，流速控制在30ml/h 左右。
4)再分别用5 倍 NTA 体积的NTA-20、NTA-50、NTA-100、NTA-250 洗脱填料，流速控制在15ml/h 左右，收集洗脱液，每管收集一个 NTA 体积。
5) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。zuì为有效的方式是 SDS/PAGE 分析。也可以用Bradford 蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE 分析蛋白质的分布。
6) 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和用途确定。

3．溶液配方：
NTA-0 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol
NTA-20 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,20mM Imidazole(咪唑)
NTA-50 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,50mM Imidazole(咪唑)
NTA-100 Buffer：20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,100mM Imidazole(咪唑)
NTA-250 Buffer：20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,250mM Imidazole(咪唑)

B．变性条件下从包涵体中纯化His标签蛋白：

1．样品准备：
1) 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET 载体表达系列，在细胞 OD600=0.5～0.8时，用1 mM IPTG诱导1～3小时，可以获得理想的表达效率。收集细胞，置于-70℃或立即进行步骤2 操作。
2) 加入1/20细胞生长体积的GuNTA-0 Buffer和1mM PMSF。
  PMSF见水分解，需要在使用前加入。
3) 将细胞悬浮起来，冰上超声破碎细胞。
4) 室温放置30分钟，间或混匀或用磁力搅拌。
5) 13000转/分，4℃离心15分钟。取上清，置于冰上备用或-20℃保存。

2．层析：
1) 将 NTA 树脂装入合适的层析柱，层析用10倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗。
2) 将样品加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。
3) 层析用5倍NTA体积的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/h 左右。
4) 分别用5倍NTA体积GuNTA-20、GuNTA-50、GuNTA-100、GuNTA-250洗脱，流速在15ml/h左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。
5) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。zuì为有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford蛋白质测定试剂盒，快速确定蛋白质的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白质的分布。
6) 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确定。
7) 纯化的目标蛋白质需要复性，复性常用的手段可以参考有关手册确定的原则，根据蛋白质的特性来摸索具体的方案。

3．溶液配方：
GuNTA-0 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,6M Guanidium HCl
GuNTA-20 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,6M Guanidium HCl,20mM Imidazole
GuNTA-50 Buffer： 20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,6M Guanidium HCl,50mM Imidazole
GuNTA-100 Buffer：20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,6M Guanidium HCl,100mM Imidazole
GuNTA-250 Buffer：20mM Tris-HCl(pH7.9),0.5M NaCl,10% Glycerol,6M Guanidium HCl,250mM Imidazole

附：NTA树脂的再生
NTA树脂在使用若干次数(3～5次)后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率。NTA树脂再生前需要从层析柱下端流干所有溶液，估计出NTA的树脂体积，按下列次序将再生试剂加到层析柱里，在等上一再生溶液流干后，再加下一再生溶解。用户需要自行准备25%、50%、75%、(v/v)乙醇和去离子水。

NTA再生步骤：
1) 从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的Stripping Solution I洗。
2) 用2倍体积的去离子水洗。
3) 用3倍体积的Stripping Solution II洗。
4) 用1倍体积的25%乙醇洗。
5) 用1倍体积的50%乙醇洗。
6) 用1倍体积的75%乙醇洗。
7) 用5倍体积的乙醇洗。
8) 用1倍体积的75%乙醇洗。
9) 用1倍体积的50%乙醇洗。
10) 用1倍体积的25%乙醇洗。
11) 用1倍体积的去离子水洗。
12) 用5倍体积的Stripping Solution III洗。
13) 用3倍体积的去离子水洗。
14) 如果立即使用，用5倍体积的Ni Charging Solution洗，再用10倍体积的平衡溶液(NTA-0 Buffer或GuNTA-0 Buffer)洗。
15) 如果想长期储存，加入1倍体积的20%乙醇，4℃保存，使用前需要执行步骤14。

Stripping Solution I：6M GuHCl, 0.2M acetic acid
Stripping Solution II：2% SDS
Stripping Solution III：100mM EDTA(pH8.0)
Ni Charging Solution：100mM NiSO4

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