JN0107 pBalbTrx-EK质粒

我公司致力于为客户提供高纯度、低成本的活性重组蛋白，包括pBalbTrx-EK质粒在内的各类受体、细胞因子、生长因子、转录因子、激素、酶、毒性蛋白、病毒抗原等。...

特别提示：包括pBalbTrx-EK质粒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：pBalbTrx-EK质粒
产品货号：JN0107
产品规格：20次(1μg)

  本质粒以Nco I线性化方式提供，请配合BalbRec PCR产物一步无缝克隆试剂盒使用（CatNo. JN0001）。
  Trx是实验室中zuì常用的融合标签之一，能够促进目标蛋白质的溶解性和正确折叠。在需要用肠激酶（Enterokinase, CatNo. PJN0015）切除的时候，由于S Tag中存在非特异性降解位点，酶切条件难以控制，常出现两条标签带（17KD,14KD），pBalbTrx通过删除部分氨基酸序列，在保留原有Trx融合蛋白质的同时，避免了非特异性酶切，使酶切结果的判断和目标蛋白质的分离变的更加方便。在不希望使用肠激酶切割时，也可通过KpnI或BglII位点引入Tev或其他蛋白酶切割位点。
  目的基因扩增按常规方法设计引物后，在5′端引物前添加以下序列：GAC GAT GAT GAC AAG； 3′端引物前添加：TTC GGA TCC GAT ATC。注意：5′端引物从个氨基酸不能为Pro。不希望目标蛋白C端保留His Tag时，3′端引物需要加入终止密码子。

产品组成：

组份	规格
pBalbTrx-EK	1ug
BalbRec 重组酶	20μl
10×BalbRec 重组缓冲液	50μl
Control Insert（50 ng/μl）	10μl
附赠
2×pfu MasterMix (快速上样型)	1ml
2×Fast Taq MasterMix(快速上样型)	1ml
DNA Ladder 2000 Plus	100μl

图示上：经典Trx标签，不同用量的 EK酶切后标签被非特异酶切为两个片段（过量酶切会产生多个片段，未示），右图为BalbTrx-EK，酶切后显示单一的标签。





质量控制：pBalbTrx-EK线性化载体经过严格的自连测试以及连接效率测试。

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名称：大肠杆菌Tuner(DE)plysS感受态细胞
货号：BTN130564
规格：0.1mL*10
 Tuner(DE3)plysS是的Tuner(DE3)衍生菌株，为高度严紧表达宿主菌，用于毒性蛋白表达，lac 透性酶突变，可以精细控制表达水平。抗性为氯霉素(34μg/ml)。

基因型：F–ompT hsdSB(rB– mB–)gal dcm lacY1(DE3)plysS(CmR)

储存条件：干冰运输，-80℃保存，有效期6个月。

名称：酿酒酵母AH109化学感受态细胞
货号：BTN140386
规格：10×100μL
 AH109菌株来源于PJ69-2A 酵母菌株，将lacZ 报告基因引入PJ69-2A 诞生了AH109，此菌株是Clontech公司开发的GAL4 系统酵母双杂实验用菌株，MATa型，可直接转化质粒或与MATα型酵母菌株Y187 通过mating 操作进行蛋白互作验证或筛库试验。Transformation marker 为: trp1，leu2，报告基因为：lacZ，HIS3，ADE2，MEL1。AH109-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N 端1～174 位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768 ～881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。

 GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互的两个结构域：位于N 端1 ～174 位氨基酸区段的DNA 结合域(DNA-BD)和位于C 端768 ～881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD 能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD 单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD 不与AD 结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD 融合，形成 bait 融合蛋白(bait -BD)和prey 融合蛋白(prey-AD)，如果 bait和prey发生相互作用，就会促使 BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。AH109 有四个报告基因：lacZ，HIS3，ADE2，MEL1，分别由三种不同的启动子(GAL1，GAL2，MEL1)启动，这三种启动子只有GAL4 识别的17bp 核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。本产品经特殊工艺制作而成，经PGADT7质粒检测转化效率为＞104cfu/μg DNA。

菌株基因型：MATa，trp1-901，leu2-3，112，ura3-52，his3-200，gal4Δ,gal80Δ,LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2,URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ

产品组成：

成分	规格
AH109感受态细胞	0.1ml×10支
PGADT7，10 ng/μL	10μl
Carrier DNA，5μg/μL	100μl
PEG/LiAc	5ml
说明书	1份

储存条件：感受态细胞干冰运输、-80℃保存，Carrier DNA -20℃保存；PEG/LiAc 4℃保存；有效期半年。

自备试剂：目的DNA、YPDA、 SD培养基等。

使用方法：
1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。
以下实验以100μL感受态细胞为例。
2. 待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中依次加入2-5μg预冷的目的质粒、10μLCarrier DNA(95-100℃ 5分钟，快速冰浴，重复一次)、500μl PEG/LiAc，吹打混匀，30℃水浴30分钟(15分钟时翻转6-8次混匀)。
3. 42℃水浴15分钟(7.5分钟时翻转6-8次混匀)。
4. 5000rpm离心 40秒，弃上清。取400μl ddH2O 重悬沉淀，5000rpm离心 30秒，弃上清。
5. 取50μl ddH2O 重悬沉淀，涂板，29℃培养48-96小时。

注意事项：
1. 酵母菌株对高温敏感，zuì适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
2.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine 被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine 合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P - ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
3. 酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA 平板29℃，48h培养可见直径1mm 克隆；涂SD 单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm 克隆，涂SD 双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm 克隆，涂SD 三缺或四缺平板29℃，80-90h培养可见直径1mm 克隆。
4.转化高浓度的质粒可相应减少zuì终用于涂板的菌量。
5. 同时转化2-3 种质粒时可增加质粒的用量。

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