WE0149 一步法逆转录实时荧光定量PCR试

一步法逆转录实时荧光定量PCR试的品牌是百奥莱博，是优质的核酸扩增(PCR)产品，本制品仅用于生物化学研究方面，我公司专注于核酸扩增(PCR)产品的研发、生产和供应，为您提供的一步法逆转录实时荧光定量PCR试质量可靠，批间差小，且价格公道，热切盼望您选购我们的产品。...

特别提示：包括一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(低含量ROX校正染料)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(低含量ROX校正染料)
英文名称：BaldStar TaqMan One Step RT-qPCR Kit(Low ROX)
产品货号：WE0149
产品规格：100次

  本试剂盒是采用探针法(TaqMan，Molecular Beacon等)进行一步法Real-Time RT-qPCR的专用试剂盒。使用本产品进行Real Time RT-qPCR反应时，逆转录和定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，避免了污染的同时提高了实验效率。本产品的检测灵敏度高，荧光信号强，信噪比高，非常适合于RNA病毒等微量RNA的检测。其所包含的特殊缓冲系统能使逆转录酶与DNA聚合酶同时发挥zuì大功效，提高反应效率。使用本产品可以得到更宽广的线性范围，对目的基因定量更准确，重复性好，可信度高。

  ROX染料用于校正定量PCR仪孔与孔之间产生的荧光信号误差，一般用于ABI、Stratagene等公司的Real Time PCR 扩增仪。不同仪器的激发光学系统有所不同，因此ROX染料的浓度必须与相应的荧光定量PCR仪相匹配。
不需要ROX校正的仪器:(WE0148)
Roche LightCycler 480，Roche LightCyler 96，Bio-rad iCyler iQ，iQ5，CFX96等。
需要Low ROX校正的仪器：(WE0149)
ABI Prism7500/7500 Fast，QuantStudio® 3 System，QuantStudio® 5 System，QuantStudio® 6 Flex System，QuantStudio® 7 Flex System，ViiA 7 system，Stratagene Mx3000/Mx3005P，Corbett Rotor Gene 3000等。
需要High ROX校正的仪器：(WE0150)
ABI Prism7000/7300/7700/7900，Eppendorf，ABI Step One/Step One Plus等。

试剂盒组成：

组份	WE0148-100次	WE0149-100次	WE0150-100次
2×BaldStar TaqMan One Step Buffer	1.4ml	1.4ml	1.4ml
BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix	100μl	100μl	100μl
50×Low ROX	-	50μl	-
50×High ROX	-	-	50μl
RNase-Free Water	1.5ml	1.5ml	1.5ml

注意事项：
1、本试剂盒中试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2、本产品以RNA为模板进行一步法RT-PCR实验，在操作过程中应避免RNase污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时,并高压灭菌30分钟后使用。
3、本试剂盒中的各试剂应尽量避免反复冻融，反复冻融可能使产品性能下降。
4、本试剂盒必须使用特异性引物，引物的选择可根据具体实验来选择，引物设计的好坏直接影响到RT-qPCR反应的结果，设计引物时需考虑GC含量，引物长度，引物位置，PCR产物的二级结构等因素，建议采用专业的引物设计软件进行设计。
5、本试剂盒推荐使用特异性探针，建议采用专业的设计软件进行设计。


使用方法：
以下举例为常规的反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小的不同进行相应的改进和优化。(反应液的配置请在冰上进行)

1、将RNA模板、引物、2×BaldStar TaqMan One Step Buffer、BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2、PCR反应体系：

试剂	25μl反应体系	终浓度
2×BaldStar TaqMan One Step Buffer	12.5μl	1×
Forward Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Reverse Primer，10μM	0.5μl	0.2μM
Probe，10μM	0.5μl	0.2μM
BaldStar TaqMan One Step EnzymeMix	1.0μl
RNA Template	Xμl	10 pg～100ng
50×Low ROX or High ROX(可选)	0.5μl	1×
RNase-Free Water	up to 25μl

注意：
1)通常引物浓度以0.2μM可以得到较好结果，可以在0.1-1.0μM作为设定范围的参考。
2)使用的探针浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行浓度的调节。
3)通常RNA模板的量以10 pg – 100ng为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定zuì佳的模板使用量。
4)不同仪器的激发光学系统有所不同，根据使用荧光定量的仪器选择加入50×Low ROX or 50×High ROX。

3、混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4、RT-PCR反应条件：

步骤	温度	时间	循环数
逆转录	45℃	10 min
PCR预变性	95℃	10 min
变性	95℃	15 s	30-40个循环
退火/延伸	60℃	45 s

注意：
1)1)本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、5-10 min条件下实现酶的活化。
2)建议采用两步法PCR反应程序，若因使用Tm值较低的引物等原因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。

储存条件：-20℃，避免反复冻融

根据您的关注的一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(低含量ROX校正染料)，您可能还对以下产品有需求：



名称：即用型荧光定量PCR试剂盒
货号：BTN90408
规格：1mL
本产品是基于荧光染料检测的即用型PCR试剂盒，可以对靶片段进行实时定量PCR分析。产品含有经过优化的缓冲液组分、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2及荧光染料DNAgreen等所有实时定量PCR所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行实时定量PCR反应和HRM分析，具有广泛的用途。

产品特点：
1. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行实时定量PCR实验和HRM(High Resolution DNA Melt Curve Analysis)分析。而基于SYBR Green I和LC Green染料的qPCR mix则不能同时用于上述两种实验。
2. 使用第三代饱和型荧光染料，信号强，不会抑制PCR反应。
3.快捷，即用型的预配液使加样操作步骤大大简化，避免了交叉污染，降低实验误差。
4. 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能检测到浓度为50拷贝/mL的靶分子。

试剂盒组成：

成分	规格
Taq DNA聚合酶(5U/μL)	100μl
易错PCR Mix，10×	300μl
易错PCR专用dNTP，10×	300μl
MnCl2，5mM	300μl
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，保存期限为6个月。

使用方法：

1.以20μl的qPCR反应体系为例：在一干净的PCR管中，加入下列成分：

反应体系成分	20μl体系	终浓度
qPCR MagicMix，2×	10μl	1×
自备引物一	xμl	0.1-0.5μM
自备引物二	xμl	0.1-0.5μM
自备模板	xμl
自备ROX	2μl	(可以不加)
补超纯水到	20μl

放入荧光PCR仪中进行扩增，并在退火或延长步骤中记录荧光信号。
注意：
a)通常引物浓度以0.2μm可得到较好结果，可以终浓度0.1-1.0μm作为设定范围的参考；通常DNA模板的量以10-100 ng基因组DNA或1-10 ng cDNA为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定zuì佳的模板使用量。
b)ROX 校正染料：如果使用ABI公司的7500，7700和7900三种型号的荧光PCR仪器，则需用自备的ROX进行Ct值校正。对ABI 7700和7900，ROX的zuì佳浓度为1×(即在每20μl反应体系中加2μl 10×ROX)。对ABI 7500，ROX的zuì佳浓度为0.05-0.1×(每20μl反应体系加0.1-0.2μl 10×ROX；也可将10×ROX稀释到1×，然后每个反应体系加入1-2μl 1×ROX)。ROX会在溶解曲线中产生噪音，因此，如果出现了杂峰，将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打勾，然后重新分析数据。
对于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000，RotorGene3000，RotorGene 6000和LightCycler 480等型号的荧光PCR仪器，ROX不是必须的，但加入的话也不会影响整个PCR分析。

2. 循环步骤：根据扩增子的性质和仪器性能，从以下三个过程中任选一个进行扩增。
两步快速循环法：适用于引物Tm值设计为60℃的反应

循环步骤	温度	时间	循环数
酶活化	95℃	10min	1
变性	95℃	15s	35-40
退火&延伸	60℃	1min

注意：本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。
三步快速循环法：适用于延伸步骤温度高于退火步骤的PCR(长引物PCR)

循环步骤	温度	时间	循环数
酶活化	95℃	10min	1
变性	95℃	10s	35-40
退火	56-64℃	30s
延伸	72℃	32s

注意：
·退火温度：建议采用两步法PCR，退火温度60℃进行反应。若提高反应特异性，可提高退火温度，以60-64℃作为设定范围的参考。若因使用Tm值较低的引物等原 因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，三步法的退火温度请以56℃-64℃的范围作为设定参考。
·延伸温度：延伸温度设为72℃通常可以提高扩增效率。但是，对于AT含量大于70%的扩增子来说，延伸温度设为60℃为宜。
通用循环法：这种循环方法适用于几乎所有的荧光PCR仪，也适用于用快速循环法不能扩增的模版。

循环步骤	温度	时间	循环数
酶活化	96℃	10min	1
变性	96℃	15s	35-40
退火&延伸	60℃	1min

3. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在没结合DNA时，zuì大吸收光谱在471nm，结合DNA时的zuì大吸收光谱在500nm，zuì大发射光谱在530nm。

注意事项：
1. 如果使用iCycler，可以不加入FAM。
2. 如果使用Roche LightCycler的玻璃毛细管进行PCR，需加入终浓度为0.5mg/mL的自备BSA。

关注一步法逆转录实时荧光定量PCR试剂盒(低含量ROX校正染料)，的同时，为您推荐更多您可能感兴趣的产品：

货号	名称	规格
BTN90302	25mM氯化镁溶液(PCR级MgCl2溶液)	5mL
WE0106	2×BAmp MasterMix(含染料)	5ml
ALH199	20×Sybr Green I(荧光定量PCR级)	20μl×100次|20μl×1000次
SY0289	耐热逆转录酶I	2000U
HQF11	全血免抽提直接PCR试剂盒	100次/500次/1000次
MT0019	一步法高保真RT-PCR MasterMix	250T|5000T

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