XH006 酵母线粒体DNA提取试剂盒

酵母线粒体DNA提取试剂盒是高品质的DNA提取纯化产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于生化实验研究等领域，本品质量稳定，价位合理，需要酵母线粒体DNA提取试剂盒等DNA提取纯化产品的客户，请到我公司官网联系我们。...

特别提示：包括酵母线粒体DNA提取试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：酵母线粒体DNA提取试剂盒
英文名称：Yeast Mitochondrial DNA Extraction Kit
产品货号：XH006
产品规格：50T|100T

本试剂盒用于从酵母中分离出完整而纯化的线粒体DNA。利用差速离心得到比较纯净的线粒体，再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA，zuì后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。

试剂盒组成：

组份	50T	100T	保存温度
DNase I	12mg	22mg	-20℃溶解后分装
RNase A	0.5ml	1ml	-20℃保存经常使用可2～8℃放置
蜗牛酶	500mg	1g	-20℃
β-巯基乙醇	1.0ml	1.0ml	RT
山梨醇缓冲液	30ml	60ml	2～8℃
原生质体裂解液	100mL	200 mL	2～8℃
线粒体清洗液	25 mL	50 mL	2～8℃
DNA酶反应液	6ml	12ml	2～8℃
线粒体裂解液	10ml	20ml	常温放置， 如有沉淀可37℃水浴
蛋白沉淀液	7.5ml	15ml	2～8℃
核酸助沉剂	0.5ml	1ml	2～8℃
TE缓冲液	25ml	50ml	2～8℃

保存条件：2～8℃可保存一年，DNASE I、RNase A和蜗牛酶-20℃保存。使用前，在DNASE I中加入600μl（50T）或者1100μl（100T）的DNA酶反应液，分装后-20℃保存三个月，如果超过三个月，活性可能会降低，请自行订购DNASE I。线粒体裂解液使用前常温保存，如有沉淀可37℃水浴溶解，不影响使用。

操作步骤：
准备工作：在DNASE I中加入600μl（50T）或者1100μl（100T）的DNA酶反应液，适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温，如有沉淀37℃水浴溶解，离心机温度下降到4℃（2～8℃），如无低温离心机，也可以常温离心，并将离心时间减半，但zuì后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。

1．取新鲜培养的1-5ml酵母培养物(约5×10⁷细胞，湿重50mg或者50μl体积)离心后的收集物（4℃，1000×g离心5min）。双蒸水洗一到两次。离心，尽量弃上清。取50μl山梨醇缓冲液洗一次，离心，弃上清。
2．酵母沉淀用0.5ml山梨醇缓冲液重悬，加入10mg蜗牛酶，再加入5μl β-巯基乙醇，混匀（如果一次提取样本较多，可取0.5ml山梨醇缓冲液重悬，加入10mg蜗牛酶，再加入5μl β-巯基乙醇预混匀，混匀后每管样本加入0.5ml重悬酵母），30℃水浴1-2小时。4℃，1000×g离心5min，弃上清，得到原生质体。将得到的原生质体用0.5ml原生质体裂解液重悬，再次离心，弃上清，得到原生质体。
3．将得到的原生质体用0.5ml原生质体裂解液重悬，并转移到小容量玻璃匀浆器内，0℃冰浴研磨10~20次；
4．将研磨物放置合适的离心管，4℃，1000×g离心5min；
5．取上清，加入一新的离心管中，4℃，16,000×g离心10min。离心后的上清含胞浆成分，可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底。
6．在线粒体沉淀中加入0.5 mL线粒体清洗液重悬线粒体沉淀，4℃，1000×g离心5min；取上清，加入一新的离心管中，4℃，16,000×g离心10min。弃上清，高纯度的线粒体沉淀在管底；
7．加入100μl DNA酶反应液重悬线粒体，吹打均匀后，再加入10μl DNASE I溶液（见准备工作），混匀，37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA。4℃，16,000×g离心5min。尽可能的弃上清，再加入200μl TE重悬线粒体沉淀，4℃，16,000×g离心5min，洗去残留的DNA酶。
8．得到的沉淀，用200μl TE缓冲液重悬线粒体沉淀，加入10μl RNase A。加入200μl线粒体裂解液，轻轻混匀（不可吹打），放置1～2min，再加入150μl蛋白沉淀液，迅速混匀。4℃，16,000×g离心5min。此步骤可进一步去除核DNA。
9．取上清，加入一新的离心管中（如用于酶切分析，可加入此步：选用等体积的酚lǜ仿异戊醇25:24:1抽提一次，再用lǜ仿抽提一次，或者直接用lǜ仿抽提两次，一般来说，此步可去掉一些微量蛋白及糖类，但会造成线粒体DNA的损失，因而用于PCR时可省，并不影响后续实验），加入0.6倍体积的异丙醇（如无异丙醇，可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA，如离心管太满可分两管）及5-10μl核酸核酸助沉剂，混匀，-20℃沉淀半小时左右（此步可省），4℃，16,000×g离心10min。
10．弃上清，再加入1ml 70%乙醇清洗，4℃，16,000×g离心5min。重复用70%乙醇洗一次。
11．弃上清，再次离心1min吸弃上清，不要碰到管底，开盖凉干约5-10min。
12．加入20-30μl TE缓冲液,轻弹管底，37℃水浴5分钟，线粒体DNA溶解。
13．进行DNA电泳检测及-20℃保存，进行下步的实验。

注意事项：
1．为保证获得完整及尽可能多的线粒体，匀浆条件要示：是全程低温操作。第二是快速。第三，如有条件可将匀浆后的碎片在显微镜下观察。
2．如进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接在第6步的沉淀中加入上样缓冲液裂解线粒体。
3．线粒体DNA本身含量很低，如果电泳检测不到，可加大上样量，用更少量的TE溶解沉淀，或者直接进入PCR检测。
4．以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此计算离心速度。

一般低温度心机都有离心力显示，如果没有，可以用以下公式简单的换算。
  G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]²
G为离心力，一般以ｇ（重力加速度）的倍数来表示；[rpm]²即：转速的平方；R为半径，单位为厘米。

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货号	名称	规格
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名称：柱式动物DNA提取试剂盒
货号：BTN71206
规格：50次
本试剂盒是在我司动物DNA提取试剂盒的基础上改良而得的柱式升级产品，主要用于快速提取新鲜或冷冻的动物组织中的基因组DNA。

产品特点：
1. DNA更加纯净，大多数DNA样品的OD260/280值在1.8-1.9之间。
2. DNA产率一般在200μg/g左右(跟组织种类密切相关)。
3.可直接用于PCR、酶切、杂交等后续反应。
4. 操作更加简单，离心吸附操作代替离心沉淀，整个过程室温操作约10分钟，适合大规模样品处理。
5. 安全，本试剂盒对人体，无腐蚀性和刺激性气味。
6. 高，质量和国外同类产品相当，但价格更。

试剂盒组成：

成分	规格
溶液A	40ml
溶液B	20ml
溶液C	50ml
离心吸附柱	50套
通用洗柱液	50ml
DNA洗脱液2.0	10ml
说明书	1份

储存条件：常温运输和保存、有效期一年。

使用方法：
注意：溶液A容易产生沉淀，溶液B十分粘稠，用前均需要在65℃水浴中加热使沉淀溶解或粘稠度降低，用前充分摇匀。

1. 根据使用材料的不同进行下列操作：
a)对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10平方厘米细胞中加入0.8mL预热的溶液A，用枪充分吹打以确保细胞全部裂解，然后把裂解液转移到1.5mL塑料离心管中。
b)对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106悬浮细胞中加入0.8mL预热的溶液A，用枪充分吹打以确保细胞全部裂解。然后把裂解液转移到1.5mL塑料离心管中。如果是fibroblasts或carcinoma细胞，0.8mL溶液A的细胞使用量不要超过1×106个细胞。
c)对新鲜或冷冻的组织：先将剪切成小块的新鲜组织或冷冻保存的组织放入10mL或15mL塑料离心管中，每50-100mg组织加0.8mL预热的溶液A，用剪切式匀浆器匀浆30秒左右，然后把裂解液转移到1.5mL塑料离心管中。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织(细胞中含大量正在复制的DNA)，建议组织的使用量不要超过50mg。
d)对DNAhold保存组织：先用纸吸去DNAhold液体后再剪切成小块，其余操作同新鲜或冷冻组织的处理。
2. 加入0.4mL预热的溶液B到裂解液中。由于溶液B十分粘稠，可将1mL枪头剪掉一截再用，也可以用称量方法加0.4 g。加入溶液B后需要颠倒数次充分混匀。
3. 65℃水浴5-10分钟。如果室温放置，DNA产量将降低10-20%。
4. 加入0.2mL自备lǜ仿，振荡器上充分振荡混均30秒，此时溶液将呈乳白色。一定要确保离心管底的液体被震荡起来。
5. 12000～15000g室温离心2分钟。上清透明，中间层为白膜(蛋白层)。
6.小心将上清液平均转移到两个新的离心管中，避免触及中间的白膜。
7. 每个管中加入1.5倍体积的溶液C，充分颠倒混匀。
8. 分两次上柱(即先转移一半的混合液到离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液，然后再将剩下的混合液到离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液)。
9. 加0.7mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液。
10. 加0.3mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12000～15000g室温离心半分钟，弃穿透液。
11. 12000～15000g室温再离心半分钟。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会污染DNA。
12.室温放置半分钟使残留乙醇挥发。
13. 将离心吸附柱转移到一新的1.5mL塑料离心管中，加入50-100μL DNA洗脱液2.0，室温放置离心吸附柱1-2分钟。
14. 12000～15000g室温离心半分钟，离心管中溶液即为DNA样品，可以立即使用或存放于冰箱待用。

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