MQ0066 Y187酵母感受态细胞

Y187酵母感受态细胞是高品质的克隆与表达产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于生化实验研究等领域，Y187酵母感受态细胞是我司众多优质克隆与表达之一，质量堪比同类进口产品，价格非常优惠，目前正热烈促销中，恭候您的咨询订购。...

特别提示：包括Y187酵母感受态细胞在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：Y187酵母感受态细胞
英文名称：Y187 Chemically Competent Cell
产品货号：MQ0066
产品规格：10×100μl/50×100μl

Y187菌株是GAL4系统酵母单杂，双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒或与MATa型酵母菌株(Y2HGold，AH109等)通过mating操作进行筛库试验。
Transformation marker为：trp1，leu2，报告基因为：lacZ，MEL1。
Y187-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：PGBKT7和PGADT7。
质粒PGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达DNA-BD(来自酵母转录因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；
质粒PGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768 ~881位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。
GAL4系统原理：一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互的两个结构域：位于N端1 ~174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768 ~881位氨基酸区段的转录激活域(AD)。
DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS，并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。
BD和AD单独存在不能激活转录，但当二者接近时，则呈现完整的GAL4活性，使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常条件下，BD不与AD结合，将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合，形成bait融合蛋白(bait-BD)和prey融合蛋白(prey-AD)，如果bait和prey发生相互作用，就会促使BD和AD的相互接近，形成完整的GAL4，从而激活报告基因的转录。
Y187有两个报告基因：lacZ，MEL1，分别由两种不同的启动子(G1，M1)启动，这两种启动子只有GAL4识别的17bp核心区相同，其余部分均不同，大大降低了酵母双杂假阳性发生的概率。Y187感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，经PGADT7质粒检测转化效率>104cfu/μg DNA。
保存条件：-80℃
基因型：
MATα，ura3-52，his3-200，ade 2-101，trp 1-901，leu 2-3，112，gal4Δ，met–，gal80Δ，URA3：:GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ，MEL1
操作说明：
1.取100 μl冰上融化的Y187感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg，Carrier DNA(95-100度5min,快速冰浴，重复一次)10 μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30度水浴30分钟(15 min时翻转6-8次混匀)。
2.将管放42度水浴15min(7.5 min时翻转6-8次混匀)。
3.5000 rpm离心40s弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s弃上清。
4.ddH2O 50μl重悬，涂板,29℃培养48-96h。
注意事项：
1.感受态细胞zuì好在冰上融化。
2.转化高浓度的质粒可相应减少zuì终用于涂板的菌量。
3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。
4.Y2HGold酵母菌株对高温敏感，zuì适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。
5.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylamino imidazole(AIR)在细胞中积累而使菌落变为粉红色。
6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆。

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名称：一站式TA克隆试剂盒
货号：BTN90801A
规格：20次
TA克隆就是利用T载体两个3′端各带有一个T突出，而PCR扩增产物两个3′端各带有一个A突出的特点，在DNA连接酶的作用下，将PCR产物克隆到T载体中的过程，它是克隆PCR扩增产物的主要手段。

产品特点：
1.一站式，用户只需要准备PCR产物即可进行TA克隆。
2. T载体由Xcm I酶切方法制备，两个5′端含T突出，自连率几乎为零。
3. 克隆效率高，一次TA克隆实验一般能得到上百个重组子。
4. 阳性率高，一般能到90%以上，大大缩短了筛选工作。
5. 提供供两次实验用的对照插入片段，方便分析实验数据。
6. 插入位点两侧有对称的常见酶切位点(如EcoR I)，便于对克隆的PCR片段进行近一步的分析。
7. 克隆位点两侧分别有T3和T7 RNA聚合酶启动子，便于用克隆的PCR片段制备RNA探针。
8.可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。
9. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α-肽编码区内，可以进行蓝白斑筛选。
10.含有丝状噬菌体f1 复制起始子，可以制备单链DNA。

成分	规格
即用型蓝白T载体(50ng/μL)	20μl
对照插入片段(50ng/μL)	5μl
T4快速连接缓冲液，2×	100μl
T4 DNA连接酶(5U/μL)	30μl
超纯水	1ml
感受态细胞	100μL×10只(只B型有)
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。感受态细胞需要干冰运输，-70℃保存，有效期6个月。

自备试剂：插入片段。

使用方法：

一：PCR产物的纯化和定量注意事项
1. 由于PCR体系中有大量会抑制DNA连接反应的dATP、还有一些可能在电泳胶上不一定会显示出来的非特异性扩增产物和引物二聚体，所以PCR产物必须用胶回收方法制备才能用于本试剂盒的连接。可以分别使用本公司柱式DNArc(BTN60202)和PAGE DNArc(包括柱式PAGE DNArc)从琼脂糖胶和PAGE胶上纯化回收PCR片段。具体操作见相关产品使用手册。
2. 琼脂糖胶回收的电泳缓冲液zuì好不要使用TBE缓冲液，因为它会影响DNA的胶回收效率。
3. 为避免UV对DNA的伤害，切胶zuì好在日光下进行(使用百奥莱博的绿如蓝染料的话，可以直接在黑色背景下看见DNA条带，不需要紫外光)。如果使用EB或其他染料，必须在紫外下切胶时，zuì好选择长波(360nm)紫外灯并以zuì快速度切胶，文献报道短波UV(300nm和240nm)会使DNA连接效率降低400多倍。使用短波UV时，可以使用百奥莱博的DNA防护剂UV Scavenger(BTN60601)减少伤害。
4. PCR片段的体积越小越便于后续操作。洗脱PCR片段时，用zuì少量的洗脱液洗脱。
 本试剂盒要求PCR回收片段的浓度zuì好为50ng/μL。如果浓度不够，zuì好用醇沉淀法沉淀后直接在管内设置连接反应，也可以使用本公司的核酸浓缩剂(BTN110801)直接浓缩。
5. 为准确定量回收的PCR产物同时又节约样品，zuì好使用微量分光光度计(只需用1μL样品测量)。如果分光光度计需要大量样品，建议使用电泳法定量：将回收的PCR片段与浓度已知的DNA Marker在含EB或绿如蓝染料的琼脂糖凝胶中电泳，通过比较DNA条带的相对荧光强度而估测PCR产物的浓度。

二：连接反应
1. 短暂离心装有蓝白T载体、连接缓冲液和T4连接酶的离心管。
2.在三个离心管中加入下列成分(注意，对照可以不做，在出现问题时再做)：

成份	样品管	阳性对照管	自连对照管
T4快速连接缓冲液，2×	5μl	5μl	5μl
蓝白T载体(50 ng/μL)(=0.03 pmol/μL)	1μl	1μl	1μl
自备PCR 纯化产物(0.03-0.1 pmol/μL)	Xμl(见注)	不加	不加
对照插入片段(50ng/μL)(=0.06 pmol/μL)	不加	1.5μl	不加
T4 DNA连接酶(5U/μL)	1-1.5μL	1-1.5μL	1-1.5μL
超纯水	补到10μL	补到10μL	补到10μL

注: 如何根据T载体的用量计算PCR纯化片段的zuì佳用量？
：确定插入片段与载体的zuì佳摩尔比，在本产品的T载体的长度固定(3Kb)时，zuì佳摩尔比跟插入片段的长度关系如下：

插入片段长度	与载体的摩尔比
1Kb以下	2:1或3:1
跟T载体接近(±1Kb)	1:1
比T载体长1Kb或更多	1:2或1:3

第二：根据选定的zuì佳摩尔比按下面方程式计算用量：

本产品提供的T载体长度为3 Kb，推荐用量为50ng，如果PCR片段长度为0.5 Kb，zuì佳摩尔比设定为3:1，则其用量为:

3. 用移液器吹打连接反应液使之混匀，然后放置在16℃孵育30分钟-过夜。
4. 65℃5分钟灭活连接酶后直接用于转化或-20℃保存。

三：细菌转化及筛选(仅供参考，本产品不提供相关试剂)
1. 将100μl转化效率在1×108 cfu/μg以上的感受态细胞于冰上解冻。
2. 取5-10μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物。
3.在冰上放置30分钟。
4. 将离心管放42℃热休克90秒，然后快速将其转移到冰浴中放置1～2分钟。
5. 每管中加900μl LB培养基，37℃振荡培养1小时复苏细胞。
6. 将100μL复苏涂布到含Amp的LB琼脂平板上(也可加上X-gal和IPTG)。
7.室温4,000rpm离心剩余的900μl复苏细胞5分钟，弃去800μl上清，用剩余100μL培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB琼脂平板上(可加X-gal、IPTG)。
8. 将平板置于室温直至液体被吸收。此步非常重要，否则培养板将在37℃排除水分，细菌将随水在培养基上到处游动，不能形成单个菌落。
9. 倒置平皿，于37℃培养，12～16小时后可出现菌落。一般情况下阳性对照组总共会有上千个菌落(100μl转化液产生的菌落数×10)，自联对照只有少数几个菌落，样品组的菌落数取决于PCR回收片段的质量。
10. 按常规方法筛选重组子。

MCS位点：


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BTN90801B	pression/BTN90801B.html" target="_blank">一站式TA克隆试剂盒(含感受态细胞)	20次
BTN120682	pression/BTN120682.html" target="_blank">杆菌肽溶液	1mL
BTN120685	pression/BTN120685.html" target="_blank">先锋霉素溶液	1mL

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