WH0078 2×富含GC片段DNA模板PCR

2×富含GC片段DNA模板PCR的品牌是百奥莱博，是优质的核酸扩增(PCR)产品，本制品用于科研试验，我公司专注于核酸扩增(PCR)产品的研发、生产和供应，为您提供的2×富含GC片段DNA模板PCR质量可靠，批间差小，且价格公道，热切盼望您选购我们的产品。...

特别提示：包括2×富含GC片段DNA模板PCR预混反应液在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：2×富含GC片段DNA模板PCR预混反应液
英文名称：2×GC rich PCR MasterMix
产品货号：WH0078
产品规格：0.5ml（不含染料)|0.5ml（含染料)

本制品包含Taq Plus DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂，浓度为2×。具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可zuì大限度的减少人为误差。适用于保真度较高的PCR反应和结构复杂的模板如GC含量高，有二级结构等的扩增。

本制品使用方便快捷，能避免PCR操作过程中的污染，使用时只需取适量2×GC MasterMix溶液，加入模板和引物，并加入ddH2O补足体积，使Mix溶液的浓度为1×即可进行反应。

适用范围：
·基因检测：本产品不同批次之间误差很小，特别适合大规模基因检测，半定量PCR实验和微量DNA的检测。
·保真度较高的DNA扩增和一些有特殊结构的复杂模板如GC含量高（60%
产品组成：

组分	WH0078-1	WH0078-2
2×GC-Rich PCR MasterMix	500μl	500μl
ddH2O	500μl	500μl
Loading dye in MasterMix	Yes	No

2×GC rich PCR MasterMix：
0.1U Taq Plus Polymerase/μl，500μM dNTP each，20mM Tris-HCl （pH8.3)，100 mM KCl，3 mM MgCl2，其它稳定剂和增强剂

储存条件：-20℃可长期保存，多次冻融不会影活性。如需经常使用，可存放于4℃

质量控制：
经检测无外源核酸酶活性；能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；室温（15-25℃)存放一周，无明显活性改变。

使用举例：
注意：以下举例仅供参考，实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据实际情况，设定zuì佳反应条件。
1.用2×GC-Rich PCR MasterMix产品，以人基因组DNA为模板，扩增TGF（1915 bp,GC 70.4%)的片段，反应体系为25 μl（如反应体系不同，可按此比例增加或减少用量）。

加入物	加入量
Template	<1μg
Primer 1（10 μM)	0.4 μl
Primer 2（10 μM)	0.4 μl
2×GC rich PCR MasterMix	12.5 μl
ddH2O	补至25 μl

2．PCR反应循环的设置：
  
3．结果检测：反应结束后取5 μl反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。

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名称：T3体外转录试剂盒
货号：BTN91108
规格：50次
本试剂盒是基于沙门氏噬菌体T3 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有T3启动子的模版DNA，以NTP为底物，从T3启动子下游开始合成与模板DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。

产品特点：
1. 即开即用，用户只需提供含T3启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需耍单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液，减少加样次数，避免了操作误差，增加了可重复性。
3. 模板DNA可以是线性化的质粒DNA，也可以是PCR扩增产物。
4.可以合成的RNA的zuì佳长度在20nt到5000nt之问。
5.产品配方经过精心优化，每μg DNA模板可以合成2-6μg RNA。
6. 得到的RNA可以用于RNA结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和RNA干扰(RNAi)等实验。

试剂盒组成：

成分	规格
转录预配液(2×)	0.5mL
阳性对照DNA(1.3 Kb片段)	20μL(10ng/μL)
T3 RNA聚合酶混合液	50μL
RNase-free水	1mL
说明书	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、制备DNA模板
PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点：
1)必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。
2)是需要转录的DNA序列的上游必须有T3启动子。如果模板是PCR产物，则可以在设计引物时将T3启动子序列(5′AATTAACCCTCACTAAAGG 3′)加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T3启动子的载体，并且克隆位点必须位于T3启动子下游。
3)是需要转录的DNA序列的下游端zuì好不要是3′突出。如果是3′突出(如选择了Pst I来线性化质粒)，则zuì好用T4 DNA聚合酶修平。
4)是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，zuì好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。

二、体外转录反应
1.在一个RNase-free的塑料离心管中，在室温下(不是在4℃下)按次序加入下列成分：

成分	加入量	备注
DNA模板	xμl	总量在50 ng-1μg(如果模板是PCR片段，建议用50ng左右；如果模板是质粒DNA，建议用1μg左右；如果用本产品提供的阳性对照，建议用4μL)
转录预配液，2×	10μl	需室温时使用
T3 RNA聚合酶混合液	1μl	本成分还含其他促进剂，所以是混合物
RNase-free水	补水到20μL

注：此为20μL反应体系的用量，对其他体积的反应体系，各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记RNA探针，则需要定做NTP分开而不是NTP预先混合的试剂盒。如果需要得到加帽RNA，则需要加入自备的加帽修饰核苷酸(本公司有各种加帽修饰核苷酸)。
2. 37℃保温1-2小时。注意：延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热10分钟灭活T3 RNA聚合酶。
4. 取1-3μL电泳检测转录效果。一般1μg DNA可以合成 5-10μg的RNA。
5. 得到的RNA可以放-80℃保存。

若需进一步去除DNA模板，可参考下列操作步骤，但所用试剂需另行购买，本试剂盒不提供。
1.在体外转录结束后，在反应体系中加入3-5U自备的RNase-free DNase(BTN90903；3-5U/μL)。
2. 37℃保温15-30分钟。
3. 补水到100μL，
4. 用自备的等体积(100μL)的Tris饱和酚-lǜ仿抽提一次去除残留的DNase和RNA聚合酶。
5.在上清中加200μL自备的微量核酸沉淀剂(BTN50903；用前需要摇晃混匀)，振荡后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
6. 加入1mL 75%乙醇，震荡10秒后15000rpm离心3～5分钟，弃上清。
7. 短暂离心数秒，用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟，所得沉淀即去除DNA模板后的RNA。可溶于RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。

疑难解答：
1、没有RNA产物。zuì常见原因是DNA模板有RNase污染，测试方法是用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。本试剂盒缓冲液和酶混合液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。
2、RNA产量低。zuì常见的原因是DNA模板序列。在转录序列的个和第二个碱基zuì好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。
3、RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T3 RNA聚合酶的终止序列。可以改用SP6或T7体外转录试剂盒(启动子也必须改成SP6或T7启动子)。
4、RNA长度比预计的长。T3 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，zuì多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒DNA线性化不彻底。
5、5′单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长(如12小时)，则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T3 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5′端是单磷酸的比例将大大增加。

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