WH0118 快速定点突变试剂盒

北京百奥莱博供应的快速定点突变试剂盒用于生化实验研究等领域，快速定点突变试剂盒是我司众多优质基因结构和功能之一，质量堪比同类进口产品，价格非常优惠，目前正热烈促销中，恭候您的咨询订购。...

特别提示：包括快速定点突变试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：快速定点突变试剂盒
英文名称：Fast Site-Directed Mutagenesis Kit
产品货号：WH0118
产品规格：20次

体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，多用于改造、优化目的基因；探索启动子的调节位点；以及研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系。本试剂盒采用目前技术，可在目标载体上直接对靶基因进行单点突变，多点突变及插入或缺失突变，并且单点突变的突变率可达90%以上。另外，与以往的突变试剂盒需要多轮PCR及亚克隆等耗时耗力的步骤不同，本试剂盒的操作更为简便，从未突变菌株到突变菌株的构建只需要4步，如下图所示：


试剂盒提供的FastAlteration DNA Polymerase是一种快速高保真DNA聚合酶，该酶保真性能优良，灵敏度高，扩增速度可达15~30 sec/kb，并且zuì高可扩增长度为10 kb的质粒DNA。试剂盒附带的FDM感受态细胞具有体内降解甲基化质粒的功能，可以对未被Dpn I降解掉的质粒模板进行进一步的降解，因此可以保证试剂盒具有更高的阳性率。同时，本试剂盒还为客户提供了对照质粒和引物，方便客户查找实验问题。

产品特点：
·简便快速：试剂盒采用非链取代式质粒扩增技术，只需4步即可实现由非突变菌株到突变菌株的转变，而不需要多轮PCR及亚克隆等耗时耗力的步骤。
·引物：试剂盒采用部分重叠的引物设计原则，可以扩增得到更多的突变质粒。
·应用广泛：本试剂盒不但可进行单点突变，还可以进行多点突变，且突变点数可达5个。
·适应性强：本试剂盒zuì大可对10 kb的质粒进行定点突变，基本覆盖所有常用质粒。
·突变率高：本试剂盒具有体外和体内双重消化甲基化质粒模板的功能，可以保证更高的突变率。对于单点突变而言，本试剂盒的突变率可达90%以上。

适用范围：
·改造优化目的基因和载体；
·分析启动子上与调控蛋白结合的关键位点；
·研究蛋白质结构和功能之间的关系。

试剂盒组成：

组分	规格
FastAlteration DNA Polymerase（1U/μl)	20μl
5× FastAlteration Buffer	200μl
Dpn I restriction enzyme（20U/μl)	20μl
4.5 kb Control plasmid（5ng/μl)	40μl
Control primers（5μM,each)	80μl
FDM competent cells	20×50μl

储存条件：于-20℃条件下保存。感受态细胞-70℃条件下保质期6个月，试剂盒其他组分在-20℃条件下保质期1年。

注意事项
1．在进行单引物多位点突变时，由于增加了突变位点个数，所以突变率较单点突变时会有所降低，根据我们的实验数据，当突变位点个数达到5个时，突变阳性率会降低到50%。因此建议客户要增加验证的克隆子数。
2．本试剂盒支持多引物多位点突变，这样可以在基因内更广泛的范围内进行突变实验。突变位点个数的上限仍然是5个。
3．建议在进行新的突变实验时要带上试剂盒附带的对照质粒和引物，以便于对实验问题进行分析。

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名称：5′RACE试剂盒
货号：BTN101105
规格：10次
研究真核基因的zuì基础的工作之一就是确定其转录终止位点，目前zuì通用的方法是5′-RACE法，RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)是Frohman发明的、通过PCR快速克隆cDNA末端的技术，它在不建立cDNA文库的前提下，利用已知cDNA序列设计引物，通过往两端延伸和扩增获得其5′-端序列。本试剂盒就是根据5′-RACE原理而开发。RACE的原理如下图：


产品特点：
1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。
2.反应条件经过精心优化，包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。

试剂盒组成：

成分	规格
MMLV逆转录酶-RI混合液(RNase H-，200U/μL)	10μl
MMLV Buffer-dNTP混合液	60μl
微量核酸沉淀剂	400μl
TdT(末端转移酶)	10μl
2×TdT Buffer(含dATP)	100μl
PCR MagicMix 3.0	1.5ml
5′-RACE引物A-引物B混合液	100μl
5′-RACE引物C	100μl
RNase-Free水	1ml

储存条件：低温运输、-20℃保存、有效期一年。

使用方法：

1.变性模板RNA：将1μg mRNA或5μg总RNA加入到一个RNase-free的PCR管中，补RNase-Free水到9μL，65℃保温5分钟后短暂离心，立即放冰上待用。如果RNA浓度偏低，体积超过9μl,可以使用本公司的核酸浓缩剂(需另购,产品编号为BTN110801)浓缩到所需的体积。
2. 设置RT反应(用户可以根据需要设阴性对照)：在上步的含变性后的RNA模板的PCR管中，按顺序加入：

成分	用量
自备的基因专一性引物A(10μM)	4μl
MMLV Buffer-dNTP混合液	6μl
MMLV逆转录酶-RI混合液	1μl
合计	20μl

3. 37℃保温60分钟，42℃保温30分钟，50℃保温10分钟，zuì后75℃保温10分钟使逆转录酶变性。
4. 短暂离心5秒后待用。
5.在PCR管中加入40μl微量核酸沉淀剂(本产品含不溶的核酸助沉剂，用前需要充分摇匀再取用)，震荡混匀。
6.室温12000rpm离心15分钟，小心吸弃上清。
7. 加入1mL自备75%乙醇，室温12000rpm离心5分钟，小心吸弃上清。
8. 短暂离心数秒，小心吸弃残留液体后，稍微晾干后加入10μL RNase-free水，充分吹打溶解，得到cDNA溶液。注意：为保证加尾效率，溶解cDNA的RNase-free水zuì好不要超过10μl。
9. 加尾反应：在10μL cDNA溶液中加10μL 2×TdT Buffer(含dATP)和1μL TdT酶，轻柔吹打混匀。
10. 37℃保温15分钟进行加尾反应，然后75℃保温3分钟灭活末端转移酶。
11. 加入0.5mL RNase-free水稀释加尾反应体系。此稀释液将作为PCR的模板。
12. 轮PCR：用不同量的稀释后的加尾反应液设置PCR反应(样品组zuì好设用量梯度，单位：μL)。

成分	梯度1	梯度2	梯度3	梯度4
PCR MagicMix 3.0	25	25	25	25
自备基因专一性引物B(10μM)	2.5	2.5	2.5	2.5
5′RACE引物 A-引物B混合液	2.5	2.5	2.5	2.5
稀释后的加尾反应液	1	5	10	15
RNase-free 水	19	15	10	5
合计	50	50	50	50

13. 按下列条件进行 PCR(注：应根据实际情况选择适当的退火温度)。
 第1次循环：94℃ 5分，48-52℃ 2分，72℃ 4分
 第2-30次循环：94℃ 40秒，52-60℃ 1分，72℃ 3分
 zuì后延伸：72℃ 15分
14. 取10-20μL PCR产物进行琼脂糖电泳电泳检查PCR结果，如果一条清晰的条带，则可以不做后续的第二轮PCR，而直接进行 DNA 测序或TA克隆。
15. 第二轮PCR：如果轮PCR没有一条清晰的条，则带从4管PCR产物中各取1μL分别加入到20μL RNase-free水中进行稀释，然后各取1μL分别作为4管第二轮PCR的模板：

成分	用量
轮 PCR产物的稀释液	1μl
PCR MagicMix 3.0	25μl
5′RACE引物 C	2.5μl
自备基因专一性引物 C(10μm)	2.5μl
RNase-free 水	补水至50μl
合计	50μl

16. 按下列条件进行 PCR：第 1-30次循环(94℃ 40秒，52-60℃ 1 分，72℃ 3分)，zuì后延伸：72℃ 15分
17. 取10-20μL第二轮 PCR产物进行琼脂糖电泳，一般都会有一个样品有清晰的条带出现，则可以直接进行DNA测序或TA克隆。

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