WE0254 BL21pLysS感受态细胞

BL21(DE3)pLysS感受态细胞是高品质的克隆与表达产品，由北京百奥莱博供应，本产品用于科研试验，本产品质量好，且具价格，深为用户称道，了解更多BL21(DE3)pLysS感受态细胞等克隆与表达产品请联系我司咨询订购。...

特别提示：包括BL21(DE3)pLysS感受态细胞在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：BL21(DE3)pLysS感受态细胞
英文名称：BL21(DE3)pLysS Competent Cell
产品货号：WE0254
产品规格：100μl×10支

  本产品是大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的热击转化。该菌株携带pLysS质粒，具有氯霉素抗性，适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。使用pUC19质粒检测，转化效率可达107。

产品组成：

组份	0.1ml×10支
BL21(DE3)pLysS Competent Cell	10×100μl
Control DNA pUC19，0.1ng/μl	10μl

实验前准备及重要注意事项
1、感受态细胞一定要用干冰运输。感受态细胞应在-80℃下保存，不可反复冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
2、转化所有步骤均在无菌条件下操作。
3、包装中有0.1ng/μl的pUC19DNA，供对照试验使用。

使用方法：
1、取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。以下实验以50μl感受态细胞为例。
2、待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA(根据实际情况加入适量的DNA，通常100μl感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和)，用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。
3、42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。
4、向每个离心管中加入450μl无菌的SOC或LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，150 rpm振荡培养45分钟使菌体复苏。
5、根据实验需求，取适量已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC或LB固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，将平板置于37℃直至液体被吸收，倒置培养，37℃培养12-16小时。
注意：
1)涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA总量较少，可取200-300μl转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心(4000rpm，2分钟)后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。
2)新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。
3)涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。

储存条件：-80℃。

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名称：单细胞悬浮液
货号：BTN130805
规格：1mL
本产品是单细胞悬浮溶液，本产品与后续各种单细胞分析实验、单细胞扩增实验兼容。

储存条件：低温运输，4℃保存，有效期一年。

名称：pUCm-T载体
货号：BTN160101
规格：1μg
本产品是一种克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。本载体由pUC系列载体改造而成，在pUC载体的多克隆位点处插入特殊的限制性内切酶识别位点，酶切后能在载体的3′端形成悬挂的“T”末端。很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA 每条链的3′端加上一个突出的碱基A。这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT 配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到，pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。可以通过蓝白斑筛选有插入片断的重组克隆，大大提高了3′末端A 突出PCR产物的连接、克隆效率。本产品应用于进行TA 克隆，克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物可以用M13通用引物进行DNA 测序。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一. 实验准备
1. PCR产物3′末端带有突出的A碱基：Taq、Tth、Ampli Taq、Klen Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物3′末端均带有突出的A碱基。建议扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行回收，再进行连接转化实验。
2. PCR产物3′末端没有突出的A碱基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3′5′外切酶活性，其扩增的PCR产物末端可能不带有3′A，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先对其进行3′末端加A，再进行连接转化实验。

二.连接反应
3.在一个标准的10mL连接反应体系中，加入下列成分：

反应组分	10μl反应体系
插入的目的片段	xμL(0.2 pmol)
本产品	1μL(50 ng)
10×连接酶缓冲液	1μL
T4 DNA连接酶	3-5 U
补水到	10 L

 注意:一般zuì后加入T4 DNA连接酶。
4. 用移液器吹打反应混合液使之混匀后，16-23℃连接1～12小时(或按T4 DNA连接酶供货商提供的操作手册进行连接)。

三．细菌转化和鉴定
5. 将100μl感受态细胞置于冰上解冻后，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
6. 加入上述5μl连接液，轻轻混匀，冰上放置30分钟。
7. 42℃水浴热激90秒，再冰上放置15～20分钟。
8. 加入400μl自备的SOC培养基，37℃ 200～250rpm振荡培养1小时。
9. 4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。
10. 将细菌悬液均匀涂布在含20μl的IPTG(100mM)和100μl的X-gal(20mg/mL)的氨苄青霉素抗性的自备的LB平板上。(涂布菌液的用量可以根据连接的效率及感受态细胞的转化效率而进行适当的调整。)
11. 将平板于37℃培养1小时，然后倒置培养过夜。(先将平板正向放置1小时，以吸收过多的液体。)

四．筛选
12.转化子的蓝白筛选：
 当外源DNA片段插入到pUCm-T载体中后，由于外源DNA的核酸序列存在改变了LacZ基因的编码，从而影响了其产物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重组克隆在-gal/IPTG 平板上呈现为白色，而非重组克隆呈蓝色。选择在IPTG/X-gal 平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基，37℃培养过夜。
13.转化子的鉴定：
1)用上述培养的白色菌落的菌液抽提质粒，用PstI单酶切或用其它合适的酶切,琼脂糖凝胶电泳检查片段大小，确定是否含有目的片段。
2)用M13通用引物或其它合适的引物直接进行测序来确定是否含有目的克隆。

操作提示：
1. PCR产物的纯度：
 连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，如果电泳检测PCR产物条带弥散，或出现非特异条带，则需要切下目的条带，用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。若PCR产物电泳检测只有预期大小的明显条带，也应使用PCR产物纯化试剂盒直接纯化PCR产物，以除去引物二聚体。不经纯化的PCR产物在某些条件下可直接用于连接，但由于引物二聚体和PCR产物中其它物质的影响，造成含有插入片段的阳性克隆数减少，因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的PCR产物的阳性克隆。
2. 平端PCR产物
 具有校正活性的热稳定性DNA聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在进行PCR扩增时产生平端PCR产物。这种平端PCR产物可以进行3′末端加A 尾后连接到pUCm-T载体中，采用这种方法进行连接，可大大提高克隆的效率。
3.优化插入片段和载体的摩尔比
1)pUCm-T载体优化的插入DNA片段和载体的摩尔比为3:1，采用3-10:1的连接比例也可成功进行连接。如果你的PCR产物开始连接的不理想，则有必要优化连接比例。
2)PCR产物的量可采用以下公式进行换算：
PCR片段的量(ng)= [加入载体的量(ng)×插入片段大小(kb)/载体大小(kb)]×插入片段和载体的摩尔比
4.筛选含插入片段的转化子
插入片段成功克隆到pUCm-T载体中，可阻断β-半乳糖苷酶的编码序列，因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进行筛选。大多数情况下含有PCR产物的克隆菌为白色，如果PCR片段和LacZ基因在同一读码框内，即PCR片段碱基数是3的整数倍(含3′-A)，并且读码框无终止密码子，则重组克隆菌可能为蓝色。

质粒图谱：


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