WH0064 总RNA提取试剂

总RNA提取试剂由专业试剂供应商北京百奥莱博提供，用于科研试验，本品质量稳定，价位合理，需要总RNA提取试剂等RNA提取纯化产品的客户，请到我公司官网联系我们。...

特别提示：包括总RNA提取试剂在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：总RNA提取试剂
英文名称：Total RNA Extraction Reagent
产品货号：WH0064
产品规格：100ml

本制品具有裂解能力更强，灵敏度更高等特点。可用于从细胞和组织中提取出总RNA，在样品裂解或匀浆过程中，本制品可保持RNA完整性，同时裂解细胞，溶解细胞内含物。

本制品既适用于小量样品（50-100mg组织、5×10⁶细胞）的总RNA提取，也可用于大量样品（≥ 1g组织或≥10⁷细胞）的总RNA提取。对人、动物、植物组织提取都适用，同时可处理病毒样本、血清、体液等液体材料。1h内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白的污染，可用于RT-PCR、Northern blot和分子克隆等下游实验。

产品特点：
·改良的裂解液配方，特别适用于低含量样本、液体材料和病毒材料。
·裂解能力更强，提取灵敏度更高。
·适应材料广泛。

储存条件：2-8℃避光保存12个月。

自备试剂：lǜ仿、异丙醇、RNase-free ddH2O、75%乙醇（用RNase-free ddH2O配制）。

预防RNase污染，应注意以下几方面：
1．经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
2．使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3．RNA在裂解液RL中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4 h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
4．配制溶液应使用无RNase的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%（V/V)，放置过夜，高压灭菌。）

使用前注意事项：
1．匀浆后，加lǜ仿前，样品可在-70℃放置一个月。
2．RNA沉淀可以保存在75%乙醇中，2-8℃一个星期以上或-20℃一年。
3．若提取细菌RNA，推荐应用培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒（目录号：WH0060）

操作步骤：

1．样品处理
a．植物组织：以叶片RNA提取为例。取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在本制品中研磨，研磨要迅速，zuì好不要超过1 min。大约100mg叶片使用1ml本制品。
b．动物组织：以鼠肝脏RNA提取为例。取新鲜或-70℃冻存组织，每30-50 mg组织加入1ml本制品，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过本制品体积的10%。
c．单层培养细胞：单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×107   1)直接裂解法：直接在培养板中加入本制品裂解细胞，每10cm2面积加入1ml本制品。用取样器吹打几次。
   注意：本制品加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定。如果本制品加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。
  2)胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中，300×g离心5 min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。
  注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，造成RNA的产量降低。
d．细胞悬液：离心取细胞。每5×10⁶-10⁷动物细胞和植物细胞加入1ml本制品。加入本制品前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
e．血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积本制品（推荐0.25ml全血加入0.75 ml本制品)，充分振荡混匀。
2．将匀浆样品在15-30℃放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：4℃ 12000rpm（~13400×g)离心10min，取上清。
  注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4．每使用1ml本制品加0.2 mllǜ仿，盖好管盖，剧烈振荡15 sec，室温放置3 min。
  注意：如不能旋涡混匀，可手动快速颠倒混匀2 min。
5．4℃ 12000rpm（~13400×g)离心10-15 min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约500μl）转移到新管中。（如果要分离DNA和蛋白质，可向我公司索取提取方法)。
6．在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30 min。
7．4℃ 12000rpm（~13400×g)离心10min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
8．加入1ml 75%乙醇（用RNase-Free ddH2O配制）洗涤沉淀。每使用1ml本制品至少用1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。
9．4℃ 5000rpm（~2,300×g)离心3 min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。
10．室温放置晾干（不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3 min左右即可），根据实验需要，加入30-100 μl RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。

不同组织或细胞RNA提取预期得率：
植物叶片：100-200μg/g叶片
动物组织：6-10μg/mg肝脏组织
动植物培养细胞：5-10μg/10⁶细胞
血液：3-5μg/ml人类全血

常见问题分析：

低得率：
A．样品裂解或匀浆处理不彻底。
B．zuì后得到的RNA沉淀未完全溶解。

A260/A280<1.65：
A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高。
B．样品匀浆时加的试剂量太少。
C．匀浆后样品未在室温放置5 min。
D．水相中混有有机相。
E．zuì后得到的RNA沉淀未完全溶解。

RNA降解：
A．组织取出后没有马上处理或冷冻。
B．样品或提取的RNA沉淀保存于-5℃- -20℃，未在-60℃- -70℃保存。
C．细胞在胰蛋白酶处理时被破坏。
D．溶液或离心管未经RNase去除处理。
E．电泳时使用的甲酰胺pH低于3.5。

DNA污染：
A．样品匀浆时加的试剂体积太少。
B．样品中含有组织溶剂（如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液。

蛋白和多糖污染：
A．样品中蛋白、多糖含量高。
B．样品量太大。
C．水相中混有有机相。

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本试剂盒是专门用于从血清/血浆等液体样品中提取游离RNA的产品。

试剂盒特点：
1. 操作简单，整个过程只需要20分钟左右，不需要额外在洗柱液中补加乙醇。
2. 灵敏度高，通过RT-PCR检测到的zuì终灵敏度可以达到50拷贝/mL。
3. 安全，不需要使用苯酚和lǜ仿等有机溶液。
4.与RT-PCR和荧光RT-PCR兼容。
5. 价廉物美，远低于国外同类产品。
6.适用于各种材料，包括血清、血浆、脑脊液、尿液、粪便、培养细胞上清液等无细胞材料。

试剂盒组成：

成份	编号	规格
溶液A	BTN130978A	30mL
离心吸附柱(小提)	BTN60911	50套
通用洗柱液	BTN60408	50mL
RNA洗脱液	BTN71207	10mL

储存条件：常温运输，4℃保存，有效期一年。

使用方法：
1.在1.5mL离心管中加入0.1-0.2mL血清/血浆样品。如果样品需要富集，可以将1.5mL液体在4℃下24，000 g冷冻离心60分钟，移弃1.3mL后继续操作。
2. 加入0.6mL溶液A，振荡30秒混匀后室温放置10分钟。注意：溶液A在 4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在 65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。
3. 将溶液全部转移到离心吸附柱中，室温放置2分钟。
4. 12000～15000g室温离心1分钟，弃收集管中穿透液。
5. 加入0.8mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12000～15000g室温离心1分钟，弃收集管中穿透液。
6. 12000～15000g室温离心半分钟。
7.在离心吸附柱的滤膜的中部加入30-100μL通用洗脱液，然后将离心吸附柱套入一新的1.5mL离心管中，室温放置2分钟。
8. 12000～15000g室温离心1分钟，离心管中收集的样品即为RNA。
9. RNA样品可以直接用于RT-PCR或逆转录反应，也可放-80℃长期保存。注：游离的RNA一般含量少，不宜用电泳法检测。

疑难解答
Q：提取血清血浆等液体样品/病毒核酸(RNA或DNA)为何很难？
A：原因一是量少。病毒颗粒中的RNA或DNA是作为遗传物质保存，每个病毒zuì多只携带几个拷贝(而一个细胞中有上万种RNA分子，每种RNA有很多拷贝)，同时其长度也十分有限(一般不到细胞基因组的万分之一)，样品中病毒数往往又不是很多，使得样品中病毒核酸的量往往比一个细胞中核酸的量还少，所以操作中十分容易丢失。另外，由于得到的核酸量很少，不能使用电泳和测OD检测，只能通过PCR或RT-PCR检测，而PCR或RT-PCR的条件又需要优化，所以要确定提取是否成功十分不容易。

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