BTN130906 超级杂交液(原位杂交)

超级杂交液(原位杂交)由北京百奥莱博供货并提供相关技术服务支持，本品用于科研目的，本品质量稳定，价位合理，需要超级杂交液(原位杂交)等探针标记及检测产品的客户，请到我公司官网联系我们。...

特别提示：包括超级杂交液(原位杂交)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：超级杂交液(原位杂交)
英文名称：Super hybrid solution(In situ hybridization)
产品货号：BTN130906
产品规格：10mL

本产品为我司开发的即用型原位杂交专用核酸杂交液。既可以用于RNA原位杂交、DNA原位杂交，也可以用于FISH原位杂交等试验。

原位杂交是在一定生物结构基础之上的核酸杂交。这种结构基础可以是一条染色体；一个细菌；更大结构基础是细胞和组织。基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA 双键分子，应用带有标记的(有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、地gāo辛等非放射性物质)DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA)片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在并定位；用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。

储存条件：低温运输和-20℃保存、有效期一年。

使用方法：(以检测mRNA序列为例)

培养细胞和冰冻切片
1. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为DμLbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4. 30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合，室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5. 暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室温固定10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7.预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片加20μL预杂交液(提前加入鲑鱼精DNA，终浓度为100μg/ml)。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
 注：靶DNA的变性，DNA-DNA杂交检测中，在杂交前需要增加靶DNA的变性步骤(对mRNA的原位杂交无需此步)。样品DNA的变性可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得zuì佳条件。可以将探针的变性和样品DNA变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱80℃变性 ，处理5-10 min，后冷却至37℃进行杂交。
8.杂交——按每张切片20μL杂交液(探针浓度约为1ng/μL；杂交液提前加入鲑鱼精DNA，终浓度为100μg/ml)，加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9.杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃ 0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃ 0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液：37℃ 30分钟。甩去多余液体，不洗。
11. 根据探针标记物，选择相应显色方法显色、复染，脱水、封片。
12. 结果观察。

石蜡切片
 如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一般不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3%柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间，例如5分钟,10分钟，20分钟，30分钟。以找到zuì佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
5.其余步骤和冰冻切片6-11步相同。
6. 结果观察。

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规格：10mL

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货号：BTN90605C
规格：5次
本试剂盒是基于TdT末端转移酶能够在DNA的3′端添加dNTP尾巴的原理而设计，该反应的示意图如下：


产品特点：
1.快速，15分钟即可完成标记反应。
2. 不但可用于单链DNA和DNA Oligo标记，还可用于3′突出的双链DNA标记，但后者标记效率稍低。
3.可用同位素底物和非同位素底物(生物素和地gāo辛标记的核苷酸等)。
4. 提供不带标记核苷酸、带生物素标记核苷酸和带地gāo辛标记核苷酸三种选择。
5. 同时提供非标记的dATP，用户可以用其调节加尾长短和标记核苷酸掺入比例。
6. 标记的探针可用于电泳迁移率实验(EMSA)、原位杂交(ISH)、Northern Blot(不推荐用于低丰度RNA检测)、小RNA Northern、Southern Blot(不推荐用于单拷贝基因检测)、菌落杂交、斑点印迹杂交分析等。

试剂盒组成：

成分	规格
TdT缓冲液，5×	20μl
TdT(末端转移酶，10U/μL)	10μl
dATP，2mM	5μl
标记核苷酸	(A、B、C不同，见注)
超纯水	1ml
说明书	1份

注：A型用于自选标记，用户需自备标记核苷酸，本产品不提供标记核苷酸；B型提供5μl Biotin-11-dUTP；C型提供含5μl DIG-11-dUTP。

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：
1.在0.2mL微量离心管中按下表设置一个20μl体系的标记反应(如果需要标记更多探针，请增加标记体积而不要增加探针DNA的浓度)：

成份	用量
探针DNA	100-200 pmol
TdT Buffer，5×	4μl
标记核苷酸，1mM (A型需自备标记核苷酸)	1μl
dATP，2mM	(见下注)
TdT末端转移酶(10U/μL)	2μl
超纯水	补到20μl

注：dATP可以不加，但这样得到的加尾全部是标记核苷酸，由于空间阻碍，灵敏度不一定zuì佳。如果杂交效果不好，掺入一定比例的dATP到标记核苷酸中，以控制标记的密度，提高比活。具体比例如何可以自己优化。
2. 37℃反应15分钟，延长到30分钟也可以。如果没有非标记核苷酸存在，一般可以加尾3-5个Biotin或DIG标记的核苷酸(标记物空间阻碍抑制延长)；如果有在加尾反应中加入一定比例的非标记核苷酸dATP(其他dNTP也可，只是本试剂盒只提供dATP而已)，每条探针上可加上约100个核苷酸，平均含5个标记核苷酸
3. 70℃ 10分钟灭活TdT酶。
4. 如果需要，可以PAGE电泳+银染(相关试剂需要另购)检测标记效率，带标记的探针泳动速度将低于没标记的探针。
5. 如果是非同位素标记，探针不需纯化可以直接用于杂交。如果需要纯化非同位素标记的探针，请不要酚/lǜ仿抽提，因为非同位素标记物一般会使探针DNA进入有机相而丢失。
6. 使用时需将探针以1-8 ng/μL的终浓度加入到杂交液中(如果探针是双链DNA，加入前还需热变性)。如果不立即使用，非同位素标记的探针DNA可-20℃长期放置一年，同位素标记的探针DNA不能放置。

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