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所在地：北京
型号：HR9062
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更新时间：2023-08-09
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王欣(女士) （来电时请说是从给览网看到我的)
内质网膜蛋白提取试剂盒
产品编号：HR9062
产品组成：
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组份 |
50T |
100T |
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组份A：内质网膜蛋白提取液A |
25mL |
50mL |
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组份B：内质网膜蛋白提取液B |
25mL |
50mL |
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组份C：内质网膜蛋白提取液C |
10mL |
20mL |
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组份D：内质网膜蛋白提取液D |
10mL |
20mL |
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组份E：蛋白酶抑制剂混合物 |
100μL |
200μL |
储存条件：
蛋白提取液2-8℃保存；蛋白酶抑制剂-20℃保存，有效期1年。
【注】：
● 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
● 蛋白酶抑制剂在2-8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
产品简介：
内质网膜蛋白提取试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的内质网膜蛋白的提取。
本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift 凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。
本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白。
本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。
本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D 电泳，需要除盐后再用于2D 电泳。如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我公司其他货号的蛋白提取试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（相关产品HR0389）。
内质网膜蛋白提取试剂盒特点：
● 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
● 提取过程简单方便，将蛋白提取的时间缩短至30分钟-1小时。
● 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
● 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
● 总蛋白提取液含多种有效成分，可充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
● 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6 种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
● 离心机 ● 振荡器 ● 涡旋混匀器 ● Dounce匀浆器 ● 移液器 ● PBS（pH7.4，1×）
● BCA蛋白定量试剂盒
使用注意事项：
● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
● 最好使用Dounce匀浆器匀浆，如果没有Dounce匀浆器，也可用普通玻璃匀浆器匀浆，但是内质网蛋白回收率会下降。
● 要求离心力30000×g-50000×g的离心，最好能达到45000×g左右。最小离心力需要保证30000×g里。若实验室离心机较小达不到30000×g离心力，或者离心管质量不能承受30000×g离心力，请使用能达到的最大离心力。此时内质网得率会相对较低。 l
● 如果需要回收所有光面内质网小泡的蛋白，50000×g离心步骤的离心力需要提高到100000×g力。
内质网膜蛋白提取试剂盒使用方法：
细胞内质网膜蛋白提取：
1. 提取液制备：
每200μL冷的蛋白提取液C中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每200μL冷的蛋白提取液D中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
【注】：
● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
2. 取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；
3. 用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 加入500μL冷的试剂A，置冰上10分钟。
5. 用Dounce匀浆器匀浆充分匀浆，然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。
7. 在4℃，11000×g力条件下离心10分钟，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
8. 在4℃，30000×g-50000×g力条件下离心45分钟。
9. 在沉淀中加入400μL 冷的试剂B，混匀。
10. 在4℃，30000×g-50000×g力条件下离心45分钟。
11. 弃上清，沉淀中加入100-200μL冷的蛋白提取液C，混匀。
【注】：
● 提取液C使用前必须保持在2-8℃条件。
12. 在4℃条件下振荡30-40分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。
【注】：
● 此步骤必须在2-8℃处理。
● 用振荡器/摇床的较低转速，保持液体晃动即可。
● 没有2-8℃振荡条件也可以不振荡，置2-8℃静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
13. 在4℃，12000×g条件下离心5 分钟。弃沉淀，收集上清。
14. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴10分钟。
15. 在37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为20-30μL。
【注】：
● 此步骤必须在37℃条件下离心。
● 没有37℃离心条件也可以不离心，稍微延长37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。
16. 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。
【注】：
● 上层部分为内质网内非膜蛋白的蛋白。
● 待下游目的膜蛋白实验完成后在丢弃此部分。膜蛋白萃取不完全时此部分蛋白仍可以进行再次提取膜蛋白。
17. 用50-100μL冷的试剂D膜蛋白溶解液溶解下层内质网膜蛋白部分，即得内质网膜蛋白。
18. 将内质网膜蛋白样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。
【注】：
● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
组织内质网膜蛋白提取：
1. 提取液制备：
每200μL冷的蛋白提取液C中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
每200μL冷的蛋白提取液D中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
【注】：
● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
2. 取50-100mg新鲜动物组织样本，用PBS 洗涤干净。
3. 用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
4. 加入500μL冷的试剂A，置冰上10分钟。
5. 用Dounce匀浆器充分匀浆30-40下，至无明显固体团块。然后在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。
6. 将上清吸入另一预冷的干净离心管。
7. 在4℃，11000×g力条件下离心10分钟，将上清吸入另一预冷的干净离心管。
8. 在4℃，30000×g-50000×g力条件下离心45分钟。
9. 在沉淀中加入400μL 冷的试剂B，混匀。
10. 在4℃，30000×g-50000×g力条件下离心45分钟。
11. 弃上清，沉淀中加入100-200μL冷的蛋白提取液C，混匀。
【注】：
● 提取液C 使用前必须保持在2-8℃条件。
12. 在4℃条件下振荡30-40分钟，至沉淀充分裂解，无明显沉淀。
【注】：
● 此步骤必须在2-8℃处理。
● 用振荡器/摇床的较低转速，保持液体晃动即可。
● 没有2-8℃振荡条件也可以不振荡，置2-8℃静置，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
13. 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。
14. 将上清吸入另一干净离心管，在37℃水浴10分钟。
15. 在37℃，1000×g力离心5分钟，此时溶液分为两层，下层是膜蛋白约为20-30μL。
【注】：
● 此步骤必须在37℃条件下离心。
● 没有37℃离心条件也可以不离心，稍微延长37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。
16. 小心移除上层液体，收集上层部分留作备用分析。
【注】：
● 上层部分为内质网内非膜蛋白的蛋白。
● 待下游目的膜蛋白实验完成后在丢弃此部分。膜蛋白萃取不完全时此部分蛋白仍可以进行再次提取膜蛋白。
17. 用50-100μL冷的试剂D膜蛋白溶解液溶解下层内质网膜蛋白部分，即得内质网膜蛋白。
18. 将内质网膜蛋白样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。
【注】：
● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
常见问题分析：
● 蛋白浓度低？
处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
● 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂C中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
● 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
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