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所在地：北京
型号：HR9084-50T
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更新时间：2023-05-31
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公司地址：北京市海淀区紫雀路33号院3号楼
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王欣(女士) （来电时请说是从给览网看到我的)
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
● 离心机 ● 振荡器 ● 匀浆机/Dounce匀浆器 ● 涡旋混匀器 ● PBS ● 蛋白定量试剂盒
使用注意事项：
● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
● 如果是做核酸类下游应用，实验中所有液体以及器具均应该用DEPC处理。用0.1%的DEPC处理12小时然后高压。
● 下游用于蛋白质类实验的话可以不用DEPC 处理。
● 细胞最好采用新鲜收集的，或者收集后立即置于-80℃保存的样本。
● 最好使用标准Dounce匀浆器匀浆，如果没有标准Dounce匀浆器，用普通玻璃匀浆器匀浆也可，但是核糖体回收率可能会下降。
使用方法：
1、酵母培养物，在4℃，1000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集酵母沉淀。
2、用PBS洗涤酵母两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
【注】：
● 在1000×g离心5分钟。
3、每100μL体积或100mg湿重酵母沉淀物中加入400μL酵母核糖体提取液A，混匀后，在30℃条件下保温15分钟。
【注】：
● 酵母数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
4、在1000×g条件下离心5-10分钟，收集酵母沉淀。
5、用300μL酵母洗涤液D重悬细胞，静置10分钟，离心收集酵母。
6、酵母沉淀物中加入500μL酵母核糖体提取液B，充分混匀。
【注】：
● 根据酵母细胞量调整提取液用量，一般加菌体体积的2-5倍均可。
● 按酵母菌体体积每100μL或100mg湿重菌体加入250-500μL提取液。
7、在37℃或室温条件下轻微振荡60-90分钟。
【注】：
● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
● 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔10分钟用移液器吹打混匀。
● 不同酵母样本需要的时间差异较大，根据下游细胞裂解的难易程度调整，如果下游试剂C处理后沉淀没有明显减少，需要延长此步骤处理时间。可以延长至2小时。
8、在2000×g条件下离心5-10分钟，弃上清，收集沉淀。
9、沉淀用300μL酵母洗涤液D洗涤两次。离心收集沉淀。
10、在沉淀中加入400μL酵母核糖体提取液C，充分混匀，用Dounce匀浆器匀浆20-30下。
【注】：
● 标准Dounce匀浆器用紧杵5-8次，松杵匀浆15-20次。
● 匀浆杵一个上下来回为一次。
● 普通玻璃匀浆器匀浆一般也不超过30次，匀浆次数并非越多越好。
● 如没有匀浆器，可在加入试剂C后在振荡器上振荡10-30分钟。用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液有轻微晃动即可。没有振荡器的话，在4℃静置，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
● 试剂C 处理后沉淀应减少，否则振荡延长处理时间。
11、将匀浆液在4℃，1000×g力条件下离心5分钟。弃沉淀，收集上清。
12、将上清在4℃，3000×g力条件下离心10分钟，弃沉淀，收集上清。
13、将上清在4℃，12000×g-20000×g力条件下离心10分钟。弃沉淀，收集上清。
14、在上清中加入100μL试剂E，充分混匀。
15、置2-8℃冰箱静置过夜。
【注】：
● 静置保存时间不少于10小时。
16、在4℃条件下，10000×g离心20-45分钟。
17、小心移除上清，收集沉淀。
【注】：
● 尽可能吸干上清。
● 吸取时小心，防止吸掉沉淀。
18、沉淀用适量核糖体保存液或其他相应的缓冲液重悬。即得到酵母核糖体样品。
【注】：
● 也可不用盒中的核糖体保存液重悬，根据实验需要选择合适的缓冲液重悬核糖体或直接用于下游实验。
19、置冰箱备用或直接用于下游实验。
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