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所在地：北京
型号：HR8025-50T
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更新时间：2023-05-31
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公司地址：北京市海淀区紫雀路33号院3号楼
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王欣(女士) （来电时请说是从给览网看到我的)
试剂盒以外自备试剂和仪器：
● 离心机 ● 振荡器 ● 匀浆机/匀浆器 ● 涡旋混匀器 ● PBS(pH7.4,1×) ● 蛋白定量试剂盒
使用注意事项：
● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
● 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
● 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
● 蛋白酶抑制剂在2-8℃时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
使用方法：
1、提取液制备：
每500μL蛋白提取液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
【注】：
● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
● 可以根据需要自己添加其它蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂。
● 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。
2、取100-200mg组织样本剪碎，加入500μL蛋白提取液A，用组织匀浆器/匀浆机充分匀浆。
【注】：
● 如果组织样品很细小，可以剪碎后直接加入提取液振荡15分钟，可以不用匀浆器。
● 也可用液氮研磨的方法，常用操作即可。
3、将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中，在4℃条件下振荡20-45分钟。
【注】：
● 用振荡器/摇床的较低转速，保持液体稍微晃动即可。
● 没有振荡条件可以不振荡，置4℃静置即可，稍微延长时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
4、将振荡处理过的匀浆液在4℃，12000-16000×g条件下离心15分钟，弃沉淀，收集上清。
【注】：
● 注意只收集中间蛋白层，避免吸到上层脂肪和下层沉淀。
● 提取液液面有大量脂肪层时，建议先移除上层脂肪层，再吸取蛋白层。
5、将上清在4℃，12000-16000×g条件下离心5分钟，弃沉淀，收集上清。
6、将上清吸入蛋白脱脂离心管内管中，套上液体收集管，在4℃，10000-16000×g条件下离心10-15分钟。
【注】：
● 小心避免吸入沉淀和上层脂肪。
● 蛋白脱脂离心管可以重复利用，一般一个离心管可以用5-10次。
● 如果内管中液体不容易离心下来时，可以将离心力提高到16000×g离心15分钟。
7、将液体收集管中的液体吸入另一干净离心管，即可得到蛋白样品。
【注】：
● 蛋白脱脂离心管内管和外管用PBS 洗涤后，用于下一个样品。
● 蛋白脱脂离心管重复利用，一般一个柱子可以用5-10次。
● 洗涤时可以加入PBS用移液器吹打，吸掉PBS。再次加入新的PBS，在10000×g离心10分钟即可。
● 脱脂离心管对蛋白质没有吸附，离心后可以直接使用。
8、将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
【注】：
● 建议用BCA 法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
常见问题分析：
● 蛋白浓度低？
处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
● 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
● 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
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