HR8833-100T 组织活性氮(RNS)检测试剂盒(O52)

本试剂盒是一种利用荧光探针O52进行活性氮检测的试剂盒。在活性氮存在的条件下，O52探针与活性氮反应生成强荧光物质O52F，O52F发出的绿色荧光强度与组织内活性氮水平成正比，检测O52F的荧光就可以知道组织内活性氮的水平。O52F的荧光最大激发波长是490nm，最大发射波长是516nm。

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样本类型：

● 新鲜组织

试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：

● 荧光分光光度计或酶标仪 ● 离心机 ● PBS缓冲液/HBSS（无酚红） ● 蛋白定量试剂盒

● 荧光测定专用的黑色96孔板

使用注意事项：

● 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

● O52染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

● 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。

● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

使用方法：

试剂准备：

根据样本数量，用纯水将O52探针10倍稀释，配制成探针工作液。充分混匀，备用。

【注】：

● 不可以一次性将探针全部稀释。

● 现配现用。

● O52染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

● 微量操作时，注意探针要有效加入稀释液中，避免没有加入。

● 以下步骤使用的探针为此步骤配制好的探针工作液。

样本处理：

1、刚取得的新鲜组织样本用PBS洗净。

2、准确称取50mg或100mg组织样本，加入500μL-1 mL匀浆缓冲液A，用匀浆机/匀浆器充分匀浆。。

样本检测：

1、在96孔板中加入190μL匀浆上清液、10μL O52探针，用移液器吹打，使之充分混匀。

【注】：

● 不同样本的活性氧差异较大，需要根据预实验结果调整探针用量。一般加入2-10μL探针，染色终浓度按试剂盒中探针母液的200-1000倍稀释，200倍稀释适合大多数样本。

● 如果荧光强度太强，超过了检测仪器的量程，可以减少探针用量。保证所有样本探针用量一致即可。

● 此步加入的是经过稀释配制的探针工作液。

● 以酶标仪检测为例。也可以用荧光分光光度计检测，根据所使用仪器决定匀浆液体积和染色容器。。

2、在37℃避光孵育30分钟。

3、置于酶标仪中，后于激发波长为488nm、发射波长530nm检测荧光强度。

【注】：

● 或使用荧光光度计等其它荧光检测设备。

● 必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。

● 如果荧光强度太强，超过了仪器的检测范围，可以将孵育后的匀浆上清液用纯水稀释后再检测。一般稀释5-50倍。保证所有样本稀释倍数一致即可。

蛋白定量：

1、另取50μL上清匀浆液，用PBS大约稀释20-30倍。

2、取100μL进行蛋白定量，测定蛋白浓度（mg/mL）。

结果处理：

以荧光强度（RFU）/蛋白浓度（毫克蛋白）表示组织活性氮强度。

【注】：

● 数据与蛋白浓度的单位无关。

● 此处以蛋白浓度数据作为校正系数，对不同样品进行均一化处理。

● 荧光强度强则活性氮（RNS）含量高。

● 可以用实验中对照样本的荧光强度值为基准，待测组样本的荧光强度值占对照样本的百分比来比较活性氮（RNS）程度差异。

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