HR8274-50T 线粒体膜电位检测试剂盒(DiOC6(3)法)

DiOC6(3)是亲脂性荧光染料，其在水溶液中时荧光较弱，与脂质结合后荧光大幅度增强。在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体内膜。在细胞凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm)的崩溃，DiOC6(3)重新释放出线粒体膜。通过荧光信号的强弱来检测线粒体膜电位的变化。

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试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：

● 流式细胞仪 ● PBS或者HBSS（无酚红）

使用注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

● 始终保持平衡染液中pH值的一致性，因为pH值的变化将影响膜电位。

● 根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。

使用方法：

悬浮细胞

1、试剂配制：

根据样本数量，用37℃培养箱预热染料稀释液试剂B将DiOC6(3)荧光染料10倍稀释。再用HBSS或相应的无血清培养基或其他缓冲液将探针DiOC6(3)进行25000倍稀释，配制成染色工作液。

【注】：

● 也可以不使用本试剂盒中的试剂B，直接用HBSS等缓冲液或相应的无血清培养基稀释DiOC6(3)染料至所需浓度。

● 开始实验前，使用HBSS缓冲液或无血清培养基稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，建议至少在超过10倍范围的浓度下进行测试。一般染色终浓度为试剂盒中染料母液的200000-250000倍稀释，250000倍适合大多数细胞样本。

● 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。

● 工作液现配现用。

● 为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。

● 若细胞在染色后于不含染料的培养基中孵育，荧光信号会衰减。

2、收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。

3、用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞。

【注】：

● 300×g -500×g，2-8℃，离心时间5分钟收集细胞。

4、用500μL DiOC6(3)染色工作液将细胞重悬，细胞密度约5-10×10⁵个/ml。37℃，5% CO₂的培养箱中孵育15-30分钟。

5、常温离心收集细胞。用PBS洗涤细胞2次。

【注】：

● 300×g -500×g，离心时间5分钟收集细胞。

6、用500μL预热的HBSS或PBS缓冲液将细胞重悬。

7、用流式细胞仪或荧光酶标仪/分光光度计检测分析结果，或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。

贴壁细胞

对于贴壁细胞，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

纯化线粒体

1、把配制好的DIOC6(3)染色工作液再用DIOC6(3)孵育缓冲液(1×)稀释5倍。

2、0.9mL 5倍稀释的DIOC6(3)染色工作液中加入0.1mL总蛋白量为10～100μg的纯化的线粒体。

3、结果检测。

组织样本

组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。

结果分析：

检测时可以把激发光设置为488nm，发射光设置为500nm。

线粒体膜电位降低，荧光强度减弱。

用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的情况。

也可以用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察；用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测。

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