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所在地：北京
型号：HR8062-50T
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更新时间：2023-05-31
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公司地址：北京市海淀区紫雀路33号院3号楼
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王欣(女士) （来电时请说是从给览网看到我的)
产品特点：
● 使用方便。
● 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
● 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
● 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。
试剂盒以外自备试剂和仪器：
● 离心机 ● 振荡器 ● 匀浆机/Dounce匀浆器 ● 涡旋混匀器 ● 移液器
● 100μm细胞筛 ● PBS ● 蛋白定量试剂盒
使用注意事项：
● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
● 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
● 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。。
使用方法：
1、提取液制备：
每500μL预冷的蛋白提取液B中加入2μL蛋白酶抑制剂；每200μL蛋白提取液C中分别加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
【注】：
● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
2、取洗净擦干后并去除叶梗和粗脉的100-200mg新鲜植物叶片组织样本用手术剪刀或锋利的刀片剪切碎，切成0.5mm*0.5mm细块，加入500μL提取液A，充分混匀。
3、将悬液置振荡器上室温振荡12-72小时。
【注】：
● 使用振荡器/摇床的较低转速，保证提取液能轻微晃动即可。
● 没有振荡条件也可以不振荡，中间每隔几小时用移液器轻轻吹打混匀即可。
● 不同类型的植物样本需要处理的时间差异较大。拟南芥较易处理，鲜嫩叶片较易处理，年龄小的样本处理时间短。
● 部分细胞壁较厚的植物类型可能需要处理更长时间。可以延长至72小时以上处理以提高得率。
4、在1000×g条件下离心5-10分钟，弃上清，收集沉淀。
【注】：
● 有条件可以用100μm细胞筛网过滤提取液处理液后，收集滤液再离心。
● 没有细胞筛可以不过滤。
5、在沉淀中加入500μL提取液B，充分混匀。用匀浆机/Dounce匀浆器充分匀浆。
【注】：
● 没有Dounce匀浆器，也可用匀浆机充分匀浆或者。
● 没有匀浆器，置振荡器振荡20-30分钟。
6、将匀浆液在800×g离心5分钟。
7、收集沉淀I，将上清II移入另一干净的离心管。
8、在沉淀I中加入100-200μL冷的提取液C，高速涡旋5秒，充分混匀。
9、置4℃振荡20-40分钟。
【注】：
● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
● 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
10、在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
11、将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到核蛋白。
12、在步骤7中的上清II中加入50μL胞质提取液D，高速涡旋振荡10秒，充分混匀。
13、置4℃振荡10分钟。
【注】：
● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。
● 没有振荡条件也可以不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。
14、在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
15、将上清吸入另一预冷的干净离心管，即得到细胞质蛋白。
16、将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
【注】：
● 建议用BCA法进行蛋白定量。相关产品：HR0329。
● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。
常见问题分析：
● 蛋白浓度低？
植物核蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，尽可能增加样本量。
处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当增加试剂B的匀浆次数，并适当延长试剂A和C的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
● 用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
● 提取时出现胶状沉淀？
蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。
● 提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
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