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所在地：北京
型号：HR9100-20T
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更新时间：2023-05-31
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公司地址：北京市海淀区紫雀路33号院3号楼
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王欣(女士) （来电时请说是从给览网看到我的)
产品特点：
● 使用方便，无需超速离心，省时省力；
● 纯度高，富集量大，应用范围广；
● 获取的Exosome结构和功能完整；
● 稳定性好，便于运输，便于保存。
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
● 离心机 ● 移液器 ● PBS或者HBSS ● 纯水
使用注意事项：
● 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂。
● 以下以4ml培养基为例，实际操作时按培养基和提取液A用量体积比4：1使用即可。
● 不同细胞分泌的囊泡数量差异极大，请根据实际情况选择培养基样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。
● 一般巨噬细胞、淋巴细胞、造血细胞、胰腺癌细胞等分泌囊泡较多，其它细胞样本建议每个样培养基上清用量不少于8ml。常规的细胞样本最佳培养上清上样量为15-20ml及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。
● 条件允许的情况下可以将细胞培养上清浓缩后再提取囊泡。
● 在收获细胞时，应确定死亡细胞不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在囊泡的提取过程中会污染活细胞产生的囊泡。
● 已经分离好的囊泡样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。
使用方法：
囊泡提取：
1、收集4ml待提取的培养基样品，置2-8℃保存。
【注】：
● 冻存样品置水浴锅解冻后置2-8℃保存。
2、将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
3、小心将上清移入另一干净离心管中。
4、将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
5、小心将上清移入另一干净离心管中。
6、在4ml上清中加入1ml提取液A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。
【注】：
● 试剂A使用前请充分混匀。
7、置2-8℃冰箱静置过夜。
【注】：
● 静置保存时间不少于10小时。
8、在4℃条件下，10000×g离心60分钟。
9、小心移除上清，收集沉淀。
【注】：
● 尽可能吸干上清。
● 吸取时小心，防止吸掉沉淀。
10、取500μL囊泡保存液将沉淀重悬，用移液器轻轻吹打混匀，得到囊泡沉淀重悬液，进行下列囊泡纯化步骤操作。
清洗囊泡纯化离心管：
1、用缓冲液或纯水进行预清洗。
2、离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。
【注】：
● 可以在囊泡提取步骤中需要使用前再清洗。
● 重复使用时要仔细检查管壁上有没有裂纹。
囊泡纯化：
1、将囊泡纯化离心管内管插入所提供的一个微量离心管中。
2、向内管中加入过500μL的囊泡沉淀重悬液样本，并盖上盖子。
【注】：
● 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
● 加囊泡悬液或Buffer到内管时，可以用蓝吸头；但从内管管底吸取纯化好的囊泡时，必须用黄吸头。
3、将盖好盖子的囊泡纯化离心管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的离心管平衡。
4、以5000-8000×g离心约10-15分钟。离心至大约剩余50μL-100μL液体。
【注】：
● 离心至大约剩余50μL-100μL液体即可，不要过度浓缩。
● 如果囊泡样本的起始浓度很高，请监控离心过程，以免样本过度浓缩。过度浓缩会导致沉淀，这也可能带来样本损失。第一次做新样品时，可以离心几分钟后观察剩余液体大概体积。
● 建议将滤过液吸入1.5ml带盖的离心管（自备）中保存，一直保留到囊泡的样品分析测试完成。避免吸头戳破滤膜导致囊泡损失。
● 影响流速的因素包括样本浓度、相对离心力、离心转子的角度以及温度。500μL样本的典型离心时间大约是10至20分钟。大部分样本在离心开始后的前5至10分钟发生过滤纯化，但在离心10至30分钟后才能达到最低的纯化液体积（20μL）。
● 可以将浓缩的囊泡用PBS或HEPES等缓冲液（根据下游实验需要选择）稀释，再次离心至大约剩余50μL-100μL，这样的囊泡纯度将再次提高，残余的外源蛋白质和核酸更少。
5、离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。
【注】：
● 囊泡可能会有少量的吸附损失，吸附损失取决于囊泡浓度、与过滤纯化内管表面接触的温度和时间。为了最大限度降低损失，离心后请立即回收过滤后的囊泡样本。
6、为了回收纯化后的囊泡，将内管倒过来插在另一个干净的微量离心管中。放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；用一个类似的离心管进行平衡。
7、以1000×g离心2分钟，使纯化后的囊泡样本从纯化内管转移到收集管中。
【注】：
● 要达到理想的回收效果，请尽早进行倒置离心。
● 也可不倒置离心，直接用移液器直接吸出内管中的样品。
● 从内管管底吸取纯化好的囊泡时，必须用黄吸头。
● 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
8、吸取收集管中的液体，即得到囊泡样品纯品。
【注】：
● 可以根据下游实验需要，用相应的缓冲液稀释保存囊泡。
● 也可直接用于蛋白提取。
● 将囊泡样本-80℃保存或直接用于下游应用。
● 囊泡短期保存可以置于2-8℃保存即可，一周以上长期不用时置-80℃保存。
● 保存前可以用0.22μm或0.35μm滤器过滤除菌。
9、用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。
【注】：
● 洗涤内管时，加入400μL PBS缓冲液或其它缓冲液，用吸头反复吹打，吸掉缓冲液即可。
● 用PBS洗涤3-4次。
● 用吸头伸入内管中时，必须防止碰到滤膜，以免戳破滤膜。
● 每个离心管内管建议重复使用5次，不要超过10次。
● 加囊泡悬液或Buffer到内管时，可以用蓝吸头；但从内管管底吸取纯化好的囊泡时，必须用黄吸头。
● 如果使用过的离心管需要长期保存，可以按下列方法清洗和保存离心管内管。
囊泡纯化离心管清洗和保存：
1、使用后用水冲洗干净；
2、内管加入超纯水500μL，5000×g 离心5分钟；
3、吸净内管中的水，加入500μL 0.1M NaOH，5000×g离心20分钟；
4、用0.1M NaOH浸泡24小时；
5、用水冲洗干净；
6、用无菌水浸泡2-8℃保存。
7、外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。
【注】：
● 1个月不用的话，直接用100mM的NaOH保存！更长时间的话加0.02%的叠氮钠。
● 再次使用前，用纯水充分冲洗干净，然后根据下游实验需要，用相应的缓冲液平衡。
常见问题分析：
● 培养细胞时，如何去除血清来源的囊泡？
多数情况下，细胞在体外培时养需要血清，而血清中一般都含有囊泡，为避免血清对细胞囊泡的污染，可采用以下方法：（1）将细胞培养用的血清通过100000×g超速离心10小时以上以去除血清囊泡；（2）选择无血清培养基进行细胞培养。
● 无囊泡血清培养基（或者无血清培养基）在什么时候使用？
细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞融合度约为60%-70%时，移去原有含血清的培养基，换成新鲜的无囊泡血清培养基（或者无血清培养基），继续培养24-48h，细胞融合度达到80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取细胞外囊泡。
● 蛋白浓度低？
很多细胞外囊泡量不够下游应用，在条件允许的情况请尽可能加大培养上清的上样量。
处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。
● 囊泡纯化管内管膜会因为离心时间过长而变干么？
不会，因为内管有死体积，总会有溶液残留在内管中。死体积大约10-20μL。
● 可以重复使用过滤管么？
可以重复使用。如果使用、清洗、保存得当，可以反复使用多次。但是超过8次重复使用后过滤膜有破损风险，注意使用过程中尽量避免尖锐物品戳到膜。离心力不要过大。
● 囊泡在纯化时出现了沉淀，如何改进？
如果过滤过快或者过度浓缩都有可能引起沉淀。如果样品的囊泡浓度很高，建议降低最终的囊泡浓度，保留更多的液体。
对于因过滤速度敏感而导致的沉淀，建议的改进方法是：
1）离心力降低30%-50%
2）在过滤过程中取出过滤管，用枪头反复吹吸几次。
● 有时候用囊泡纯化离心管连水都离不下来，可能是什么原因？
如果出现这种情况，可能时过滤膜的孔被堵住。请先用0.1M NaOH清洗再离心。
最后用缓冲液或纯水再次清洗后甩干。清洗后的滤膜应立即使用，如暂时不用，请保持润湿状态，避免重新干燥。
● 说明书中推荐在室温下进行离心，考虑到囊泡的稳定性，是否可以在4℃进行离心？
可以，但是低温可能会增加囊泡样品的粘性，导致流速减慢，建议可将离心时间延长。
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