HR8369-50T Ca2+钙离子染色试剂盒(CF9绿色荧光)

可以使用荧光显微镜、酶标仪、激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。CF9的发射是比率的，使用流式细胞仪更适合，使用单一激光进行激发更为方便（通常是氩离子激光器的351-364 nm光谱线）。在无Ca2+环境中，CF9的发射从480nm 移至400nm（当与Ca2+结合时）。

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检测方法：

● 流式细胞仪 ● 荧光显微镜 ● 激光共聚焦

样本类型：

● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞

试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：

● 荧光显微镜/激光共聚焦/流式细胞仪 ● 离心机 ● 移液器 ● PBS ● HBSS

使用注意事项：

● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

● CF9染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

● 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。

● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

● 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。

● 染色后立即进行分析。

● 本染色液可用于细胞涂片、细胞的检测。

● 可以在染色溶液中加入等体积的20% Pluronic F127溶液，Pluronic F127可以帮助CF9探针更快进入细胞，不建议在Pluronic F127中长期保存CF9探针。

● 由于CF9探针在水中的稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。

● CF9探针对湿度比较敏感，每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。

● 试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。

使用方法：

1、染色工作液的配制：

根据样本数量，用37℃培养箱预热的HBSS将CF9荧光染料200-1000倍稀释，配制成染色工作液。

【注】：

● 也可以用相应的无血清培养基稀释CF9染料至所需浓度。

● 开始实验前，使用HBSS缓冲液或无血清培养基稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，建议至少在超过10倍范围的浓度

下进行测试。一般染色终浓度500-1000倍稀释，500-1000倍适合大多数细胞样本。

● 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。

● 工作液现配现用。

● 为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。

● 若细胞在染色后于不含染料的培养基中孵育，荧光信号会衰减。

2、细胞染色

悬浮细胞染色

1) 用PBS洗涤细胞2次。

【注：

● 500×g离心5分钟。根据实验室平时离心细胞的离心力离心。

2) 加入适量体积的染色工作液重悬细胞，使其密度大约为1×10⁶/mL。

3) 在37℃孵育细胞 20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。

【注】：

● 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。

4) 加入5倍体积的含有1%胎牛血清的HBSS，再继续孵育40分钟。

5) 孵育结束，500g离心5分钟。

【注】:

● 以下步骤均为洗涤细胞。根据实验室平时离心细胞的离心力和时间进行离心。

6) 弃上清液，再次缓慢加入37℃预热的HBSS 重悬细胞。

7) 重复（5），（6）步骤两次。

8) 加入HBSS 重悬细胞，在37℃下再继续孵育20分钟。

9) 然后用该细胞进行荧光钙离子检测。

贴壁细胞染色

1) 用PBS洗涤细胞2次。

2) 细胞培养板中或细胞爬片上加入适量体积的染色工作液。

【注】：

● 96孔细胞培养板每孔加入100μL染色液即可。

3) 37℃孵育细胞20分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用20分钟作为起始孵育时间，之后优化体系以得到均一的标记结果。

【注】：

● 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。

4) 吸干染色工作液，用HBSS洗培养板或盖玻片2～3次，每次用预热的HBSS覆盖所有细胞，然后吸干培养基。

5) 加入HBSS，在37℃下再继续孵育20分钟。

6) 然后用该细胞进行荧光钙离子检测。

3、用流式细胞仪或荧光显微镜检测

未结合的CF9的发射波长为480nm。结合钙离子后，发射波长下移至400nm。

采用流式细胞术可测定其波长随时间的变化，并以两个发射波长的比值表示。

【注】：

● 要优化两个发射波长比例，未结合的CF9的荧光值应使用波长大于480nm（最好选择525nm）的滤光片采集，而已结合的CF9的荧光值应使用波长小于400nm的滤光片采集。

● 由于CF9的发射波长范围较宽，不能使用Fluor450、eVolve605或eVolve655进行多色流式分析，但是利用488nm或633nm的荧光染料偶联试剂与CF9完全兼容。

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