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所在地：北京
型号：HR8685-200T
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更新时间：2023-05-31
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公司地址：北京市海淀区紫雀路33号院3号楼
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王欣(女士) （来电时请说是从给览网看到我的)
产品特点：
● 使用方便； ● 背景低,灵敏度高； ● 线性范围宽,使用方便。
检测方法：
● 流式细胞仪 ● 荧光显微镜 ● 激光共聚焦
样本类型：
● 悬浮细胞 ● 贴壁细胞
试剂盒以外自备试剂和仪器：
● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或荧光酶标仪或流式细胞仪，激发波长535nm,发射波长610nm。
● 离心机 ● 移液器 ● PBS缓冲液/HBSS（不含酚红）
使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体收集至管底,避免开盖时液体洒落。
● 荧光探针标记后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,否则会导致背景较高。
● 探针标记完毕并洗净残余探针后,可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描,以确认探针的标记情况是否正常。
● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间,以减少各种可能的误差。
● 对于药物作用时间较短(2小时以内)的细胞,先标记探针,后用药物刺激细胞。对于药物作用时间较长(6小时以上)的细胞,先用活性氧阳性对照诱导剂或相应的药物刺激细胞,后标记探针。
● DHE在光照和空气中易被氧化,注意避光密封保存。
● 对不同的细胞,应选择合适的孵育时间和浓度,以观察ROS的变化。
使用方法：
DHE探针配制：
DHE探针可在新鲜无血清培养基、各种缓冲盐溶液中稀释到所需浓度，1000-10000倍稀释,以此染色液更换细胞培养基；也可直接向细胞培养基中加入DHE探针溶液至所需浓度。
【注】：
● 开始实验前,使用HBSS缓冲液或无血清培养基稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度,建议至少在超过10倍范围的浓度下进行测试。一般染色终浓度1000-10000倍稀释,1000-2000倍适合大多数细胞样本。
● 建议收到产品后,根据单次使用量,对母液进行小量分装,每次使用一管,试剂-20℃避光冻存,一年稳定。
● 工作液现用现配。
2、依据细胞ROS含量的不同,DHE终浓度可选择在1000-10000倍稀释的范围,孵育时间可选择10-90分钟,在37℃或室温进行避光孵育。
DHE探针标记：
原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。
1、按照1:1000-2000用无血清培养基稀释DHE探针。
【注】：
● 不能用含有血清的培养基稀释DHE探针。
● 也可以用HBSS缓冲液稀释探针。
2、去除细胞培养基,用PBS洗细胞一次。
3、加入适当体积稀释好的DHE探针。加入的体积以能充分盖住细胞为宜,通常对于96孔板每孔加入100-200μL染色液；六孔板的一个孔加入稀释好的DHE探针不少于1mL。
4、在37℃细胞培养箱内避光孵育10-60分钟。
5、用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DHE探针。
【注】：
● 也可以用HBSS/PBS洗涤细胞。
收集后标记：悬浮细胞或贴壁细胞消化处理
1、按照1:1000用无血清培养基稀释DHE探针。
【注】：
● 不能用含有血清的培养基稀释DHE探针。
● 也可以用HBSS缓冲液稀释探针。
1、离心移除培养基,用PBS洗细胞一次。
2、细胞收集后悬浮于稀释好的DHE探针中,细胞浓度为1×106-2×107/ml,37℃细胞培养箱内避光孵育10-60分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。
4、用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DHE探针。
5、用无血清细胞培养基重悬细胞。
【注】：
● 也可以用HBSS/PBS洗涤细胞。
荧光显微镜检测：
1、对贴壁生长细胞,可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞,取25-50μL细胞悬液滴到一张显微载玻片上,再盖上一张盖玻片。
2、荧光显微镜下,用蓝光/绿光激发,观察和拍摄细胞红色发射图像,ROS阳性细胞在整个核区被染成红色；用紫外光激发时,胞浆中未氧化的二氢乙啶可发出蓝色荧光。
流式细胞仪分析：
1、对贴壁生长细胞,用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞,直接收集细胞。
用0.5～1ml冰冷PBS重悬细胞（5～10万）。
2、采用480～535nm波长激发,测定590 nm～610nm以上的发射,细胞应可分成两个亚群：ROS阴性细胞仅有很低的荧光强度,ROS阳性细胞有较强的红色荧光。
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