HR0015-5T 磷酸化蛋白富集试剂盒

本产品是利用磷酸基团与金属的亲和力，采用固定化金属螯合层析（IMAC）的方法富集磷酸化蛋白。可以选择性的对磷酸化蛋白和多肽进行富集和纯化。本试剂盒可以用来提取富集哺乳动物细胞、组织、细菌、酵母、植物等样本的的磷酸化蛋白。得到的蛋白样品可用于WB,mass spectrometry，2D-PAGE和protein arrays等下游应用。

北京百奥莱博科技有限公司是一家专业的生物试剂销售公司。公司主要经营血清、抗原、抗体等生物试剂产品，可以为您提供专业的技术服务，以优良的价格、优质的服务、优先的理念，满足客户的各方面的需求，与国内多家企业、单位建立了良好的长期合作关系，拥有较好的企业信誉和品牌形象。 主营产品:血清、抗体、抗原、核酸提取、核酸纯化等生化试剂

试剂盒以外自备试剂和仪器：

● 离心机 ● 振荡器 ● 匀浆机/Dounce匀浆器 ● 涡旋混匀器 ● 移液器

● 纯水 ● 生理盐水 ● 蛋白定量试剂盒

使用注意事项：

● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

● 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。

● 蛋白样品中不可含EDTA、ETT、β-ME。

● 上样蛋白样品pH值必须低于6，蛋白浓度在0.25-0.5mg/mL。

● 洗涤细胞和组织时不能用PBS等磷酸盐缓冲液，要用非磷酸盐缓冲液，如50mM HEPES，Tris等或生理盐水。

● 可以根据自己实验需要加入其它磷酸酶抑制剂单品。

● 每个新柱的载量约为1mg磷酸化蛋白，使用过的柱子经过再生反复使用的，载量会有下降。

● 用蛋白柱进行磷酸化蛋白富集，需要离心操作时将蛋白柱置于一个50mL离心管离心即可。

● 最终蛋白样品用于2D电泳前需脱盐。

使用方法：

一、蛋白样品的准备：

以下为由细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤，其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25-0.5mg/mL后直接上样即可，确保蛋白样品的pH值低于6。

可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。

细胞裂解：

1、提取液制备：每 500μL冷的裂解液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物和2μL磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】：

● 根据样品数量准备蛋白提取液,蛋白酶抑制剂混合物不可一次全加入提取液。

● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未用完,再用前需再次加入蛋白酶抑制剂。

● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

2、取5-10×10⁶个细胞，在4℃，1000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

3、用冷生理盐水洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

【注】：

● 不要用PBS等缓冲液洗涤细胞。

4、每5×10⁶个细胞中加入500μL冷的蛋白裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15-40分钟。

【注】：

● 使用振荡器/摇床的较低转速，提取液能轻微晃动即可。

● 没有振荡条件也可不振荡，稍微延长提取液的处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。

5、在4℃，14000×g条件下离心15分钟。

6、快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。

 

组织裂解：

1、提取液制备：每 500μL冷的裂解液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物和2μL磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】：

● 根据样品数量准备蛋白提取液,蛋白酶抑制剂混合物不可一次全加入提取液。

● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未用完,再用前需再次加入蛋白酶抑制剂。

● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

2、取100mg组织样本剪碎，加入总蛋白提取液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。

3、将匀浆液在4℃条件下振荡15-30分钟。

4、将组织匀浆吸入一预冷干净离心管中，在4℃，14000×g条件下离心15分钟。

5、将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白裂解液。

植物蛋白提取：

1、裂解液制备：每 500μL冷的裂解液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物和2μL磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】：

● 根据样品数量准备蛋白提取液,蛋白酶抑制剂混合物不可一次全加入提取液。

● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未用完,再用前需再次加入蛋白酶抑制剂。

● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

2、取200mg植物组织样本，去除粗筋脉络等后剪碎，置于研钵中用液氮研磨。（没有液氮也可直接置冰上研磨即可）

3、研磨后加入500μL提取液，混匀后于一个预冷的干净离心管中在4℃条件下振荡30分钟-1小时。

4、在 4℃，14000×g条件下离心10-15分钟。

5、将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到总蛋白。

细菌蛋白提取：

1、裂解液制备：每500μL冷的裂解液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物和2μL磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】：

● 根据样品数量准备蛋白提取液,蛋白酶抑制剂混合物不可一次全加入提取液。

● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未用完,再用前需再次加入蛋白酶抑制剂。

● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配制好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

2、在4℃ 12000×g条件下将菌液离心5min，弃上清，尽量吸干剩余液体，收集菌体。

【注】：

● 细菌中磷酸化蛋白量较少，请根据样本情况调整所需的样本量。

● 如果是经过基因工程改造的可以直接合成表达磷酸化蛋白的细菌样本，根据情况处理细胞，不一定按下面的步骤。

3、用生理盐水洗菌体2次。若为冷冻菌体直接进行下面操作步骤即可。

4、按每20-50mg湿重菌体样本加入500μL裂解液，吹打混匀，4℃条件下振荡30-45分钟。

5、在150w-300w，10s超声/10s间隔条件下冰浴超声至菌液变清。

【注】：

● 超声时间尽量短，提取液变清即可，一般不超过20分钟。

● 如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率过大，需要降低功率。

● 避免产生泡沫。

6、在4℃，12000×g条件下将菌液离心15分钟，将上清移入冷的干净离心管。

7、即得到细菌总蛋白样品。

二、柱平衡：

加入500μL洗柱液洗柱，重力作用下或4℃下1000×g离心1分钟甩干吸附柱。

三、上样：

将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱，重力作用下或4℃下1000×g离心1分钟甩干吸附柱。

四、洗柱：

加入300μL洗涤液洗柱，重力作用下或4℃下1000×g离心1分钟甩干吸附柱。重复两次。

五、洗脱：

加入500μL磷酸化蛋白洗脱液，重力作用下或4℃下1000×g力离心1分钟甩干吸附柱，收集洗脱液，即得到磷酸化蛋白。

六、柱保存和柱再生：

载量大幅降低后，需要再生使用的柱子，可以用1mL 0.1M EDTA溶液洗柱，然后在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2-8℃保存。

再生使用时，加入0.1M氯化铁溶液，浸泡蛋白柱填料1小时，即可对蛋白柱进行再生。然后用0.1M乙酸溶液洗柱即可。

【注】：

● 磷酸化蛋白纯化柱如果保存和处理得当的话可以多次重复使用。

● 未使用过的柱子直接室温避光保存。

● 短期保存使用过的柱子置2-8℃避光保存。

● 使用后需要长期保存时在柱中加入20%乙醇溶液密封，置2-8℃保存。

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