HR9064 TRAP染色试剂盒（改良型）

抗酒石酸酸性磷酸酶染色液以萘酚AS-BI为底物,在酸性pH下被酸性磷酸酶水解释放出磷酸和萘酚,萘酚与重氮盐偶联生成有色产物,定位于细胞质中,若细胞内的ACP有抗酒石酸的活性,则呈阳性反应。本染色液可用于细胞涂片、新鲜血涂片,亦可用于冰冻切片、石蜡切片。

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试剂盒以外自备试剂耗材和仪器：

● 光学显微镜 ● 恒温箱 ● 移液器 ● 载玻片 ● 纯水

 使用注意事项：

● TRAP孵育液易失效,本法宜用皮肤穿刺血涂片,晾干后应及时染色；

● B2：GBC染色液尽量4℃保存,尽量避免-20℃,以免潮解；

● 对冰冻切片染色时,应减少切片在室温暴露的时间。

● 样本需新鲜,取材后应立即处理,否则会影响酶的活性。

● 组织固定需在4℃冰箱进行,时间不宜超过24h,否则酶活性会减弱或消失。

● 一般不建议用石蜡切片。如果需要用石蜡切片,组织在石蜡包埋时,温度不宜高于56℃。应使用熔点为52～54℃的石蜡进行浸蜡,浸蜡时间要短,否则酶活性会减弱或消失。

 试剂的配置：

使用前,将B1：B2：B3=10:5:90混合,即TRAP孵育液,现配现用，注意充分混匀。

 使用方法：

（一） 细胞：

1、细胞用TRAP固定液4℃固定30s-3min，多数情况下30-60s即可；

2、水洗,稍微晾干（不易过分干燥）；

3、加TRAP孵育液工作液，置于37℃恒温箱,避光浸染45～60min；

4、水洗；

5、复染：苏木素染色液染色3～5min；

6、水洗、晾干、镜检。

 

（二） 血液、骨髓涂片：

1、推片：取新鲜血液或骨髓涂片置于在玻片上,推玻片于载玻片保持30度,置于血液或细胞滴液的正前方,稍往后移与血液或细胞滴液接触使后者沿推片下缘散开,再匀速沿载玻片平面平稳向前滑动至铺满血膜为止；

2、自然晾干,TRAP固定液4℃固定30s～3min,多数情况下30～60s即可；

3、水洗,稍微晾干（不易过分干燥）；

4、切片入TRAP孵育液,置于37℃恒温箱,避光浸染45～60min,水洗；

5、复染：苏木素染色液染色3～5min；

6、水洗、晾干、镜检。

 （三） 冰冻切片

1、冰冻切片回温至37℃,水中浸泡1～2min；

2、自然晾干,TRAP固定液4℃固定1～3min；

3、水洗,稍微晾干（不易过分干燥）；

4、切片入TRAP孵育液,置于37℃恒温箱,避光浸染45～60min,水洗；

5、复染：苏木素染色液染色5～8min；

6、水洗、晾干、镜检。

 染色结果：

阳性颗粒       红色-紫红色

细胞核         蓝色

 常见问题分析：

● 细胞诱导不成功？

细胞系或原代BMM细胞诱导破骨细胞时，细胞因子的质量很重要。诱导效果不好时可以考虑调整诱导条件，提高RANKL浓度或者常事是否添加M-CSF。

● 如何判断阳性细胞？

一般不通过形态变化说明，RAW细胞非常形态非常多样，形态变化并不能说明问题。一般认为多核加上TRAP阳性才能说是多核破骨细胞。

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