HR0259 RIPA裂解液(蛋白裂解试剂)

本RIPA裂解液适用于从各种动物实体组织，如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等动物组织样品中提取总蛋白。本裂解液中不含有EDTA，与金属螯合层析等下游应用兼容。本裂解液提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，

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储存条件：

RIPA裂解液2-8℃保存；蛋白酶抑制剂-20℃保存。有效期1年。

【注】：

● 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以在2-8℃保存，开盖使用后-20℃保存。

● 蛋白酶抑制剂离心至管底部再开盖。

适用样本：

● 组织 ● 细胞

产品特点：

● 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。

● 提取过程简单方便，将蛋白提取的时间缩短至30分钟-1小时。

● 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。

● 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。

● 总蛋白提取液含有多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。

● 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

试剂盒以外需自备的仪器及试剂：

● 离心机 ● 振荡器 ● 匀浆机/匀浆器 ● 涡旋混匀器 ● 移液器 ● PBS ● 蛋白定量试剂盒

使用注意事项：

● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

● 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。

● 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。

● 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑混合物不可以一次加入提取液。

● 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。

● 下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。

使用方法：

A、细胞裂解

1、裂解液制备：每1mL冷的RIPA裂解液中加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】：

● 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。

● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

2、取5-10×10⁶个细胞，在4℃，1000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

3、用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

4、每5×10⁶个细胞中加入500μL冷的裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15-20分钟。

【注】：

● 每10⁶个细胞，大约10mg或10μL细胞沉淀体积，加100μL RIPA裂解液。大约相当于6孔板的每孔加入100μL～150μL，或一个75 cm²培养瓶加1mL。裂解液和细胞应充分接触。如果RIPA裂解液不足量，细胞裂解效率将会降低。

● 使用振荡器/摇床的较低转速,提取液能轻微晃动即可。

● 没有振荡条件也可不振荡,稍微延长提取液的的处理时间,中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。

5、在 4℃，12000-14000×g条件下离心10分钟。

6、快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，用于下游实验。

B、组织裂解

1、裂解液制备：每1mL冷的RIPA裂解液加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。

【注】：

● 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶、磷酸酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。

● 以下步骤中使用的蛋白提取液为此步配好的含蛋白酶抑制剂的提取液。

2、取100mg组织样本剪碎，加入1mL裂解液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。

3、将组织匀浆在4℃振荡15-25分钟。

【注】：

● 使用振荡器/摇床的较低转速,提取液能轻微晃动即可。

● 没有振荡条件也可不振荡,稍微延长提取液的的处理时间,中间每隔几分钟用移液器吹打混匀即可。

4、在4℃，12000×g条件下离心10分钟。

5、将上清吸入另一预冷的干净离心管，用于下游实验。

上述蛋白提取物可分装后于-80℃冰箱保存备用。

【注】：

● 建议用BCA法进行蛋白定量。

● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

常见问题分析：

● 细胞裂解速度慢？

为了充分保证提取得到的蛋白的活性，提取液采用独特的保护蛋白的配方，裂解能力温和，下游应用范围广。适当延长裂解的时间即可。

● 蛋白浓度低？

处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

● 用什么方法定量蛋白？

建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

● 提取时出现胶状沉淀？

蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下,可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理,300w/10秒间隔10秒,超声3分钟,随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子,例如NF-kappaB、p53等时,不必进行超声处理。

● 提取的蛋白具有活性吗？

本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

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