SY0394 His标签蛋白纯化预装柱

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特别提示：包括His标签蛋白纯化预装柱在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：His标签蛋白纯化预装柱
英文名称：Ni-NTA 6FF Chromatography Column, 5ML
产品货号：SY0394
产品规格：5ml|5×5ml

Ni-NTA Agarose Resin 6FF以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni2+）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。此外，因其基质的耐压性（该基质可以耐受zuì高0.3 MPa的压力），该产品可以用于工业大规模蛋白的纯化，可在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化。

Ni-NTA 6FF Chromatography Column是一种以Ni-NTA Agarose Resin 6FF为填料的中压预装柱，该预装柱具有标准接口，可以适配商品化的各类中压色谱系统，如ÄKTA等，方便客户用于纯化His-tag蛋白。

基质（Matrix）：高度交联的6%琼脂糖凝胶
孔径（Bead size）：45-165µm
载量（Capacity）：＞40mg 6×His-tagged protein/ml 基质
耐压（Tolerance Pressuremax）：0.3MPa, 3bar
储存缓冲液：含20%乙醇的1×PBS
柱子尺寸（Column Size）：0.7×2.5cm（1ml）
储存条件：4℃保存，有效期2年

注意事项
1）建议纯化所用缓冲液和蛋白溶液经0.22µm或0.45µm滤膜过滤后上柱使用。
2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法
（一）纯化流程

1 缓冲液的准备
缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前zuì好用0.22µm或0.45µm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。

2 样品准备
2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达蛋白为例）
1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1mg/ml。【注】：如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10µg/ml RNase A和5µg/ml DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。
5）收集上述澄清蛋白液，10000rpm，4℃离心20-30min。取上清，0.22µm/0.45µm滤膜过滤后，置于冰上备用或-20℃保存。
2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白
将细胞培养液转移至离心瓶，5000rpm离心10min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。
【注】：对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。
2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）
1）将培养液转移至离心瓶，7000rpm，离心15min，收集菌体去上清。
2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。
3）将破碎液转移至离心管，10000rpm，4℃离心20-30min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。
4）按照菌体：裂解液（含8M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。
5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3 样品纯化（以AKTA使用为例）
1）将泵管道注满去离子水。去掉产品上塞，连接至色谱系统中，再折断下口，将预装柱连接到色谱系统中，注意旋紧。
2）3-5倍柱体积去离子水冲洗出存储缓冲液。
3）至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。推荐流速为5ml/min。
4）利用泵或注射器上样。【注】：若样品粘度增加，即使上样体积很少也会导致层析柱很大的反压；上样量不要超过柱子的结合能力；大量的样品体积也可能造成很大的反压，使得进样器更难使用。
5）Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。【注】：在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。
6）Elution Buffer一步法或梯度法进行洗脱。一步法洗脱中一般5倍柱体积洗脱液即可。梯度洗脱可以用一个小的梯度，例如20倍柱体积或更多来分离不同结合强度的蛋白质。
7）建议用更高浓度咪唑（如500mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。随后依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，zuì后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

4 SDS-PAGE检测
将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

（二）在位清洗
当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni2+脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。
1 去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类
使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1M醋酸溶液，接触时间为1-2h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。zuì后利用去离子水清洗10倍柱体积。
2 去除离子作用结合的蛋白
使用1.5M NaCl 溶液接触10-15min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

（三）填料再生
当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5Mpa），填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：
1）使用0.2M 醋酸溶液（含6M GuHCl）清洗2倍柱体积；
2）去离子水清洗5倍柱体积；
3）2%SDS清洗3倍柱体积；
4）去离子水清洗5倍柱体积；
5）乙醇清洗5倍柱体积；
6）去离子水清洗5倍柱体积；
7）100mM EDTA（pH 8.0）清洗5倍柱体积；
8）去离子水清洗5倍柱体积；
9）100mM NiSO4清洗5倍柱体积；
10）去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。

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名称：8M盐酸胍溶液
货号：BTN131120
规格：250mL
本产品为即用型盐酸胍溶液。可快速简易的制备8M以下的任意浓度，无需花费更多宝贵的实验时间处理难以称量的晶体缓慢制备盐酸胍溶液，本产品不含225-300nm处具有紫外吸收的物质，不含醛类，具有的稳定性，无颗粒物，是一种透明似水晶的溶液。经检测，本产品具有鲜明的紫外截断光谱，OD260小于0.03；典型的金属含量：铜＜0.02ppm，锌＜0.15ppm，铁＜0.25ppm，铅＜0.005ppm。

储存条件：常温运输及保存，有效期一年。

名称：预染蛋白Marker(43～200kD)
货号：BTN70704B
规格：10次
本产品为蛋白质电泳标准系列，是预染成蓝色的数个标准蛋白质的混合物，在SDS-PAGE时和转膜后可以作为分子量标准，粗略估计其他蛋白质的分子量大小。

产品特点：
1．提供干粉型或溶液型，即开即用，非常方便。
2．预染色，在电泳过程中可以观察蛋白质的泳动，也可以监测转膜效果。
3．可用于SDS-PAGE和Western Blot等实验。
4．本系列两种产品涵盖从14.4kD-200kD的分子量范围，单次上样，每个条带的浓度约为0.2μg/μL。

产品组成：

成分	A型	B型
预染蛋白标准(低分子量)	20T	-
预染蛋白标准(高分子量)	-	10T
1×SDS-PAGE上样液	0.5ml	0.5ml
说明书	1份	1份

储存条件：低温运输，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、干粉型的使用
1．开封后将1×SDS-PAGE上样液加入到样品管中溶解蛋白质粉末，各分子量标准所需的1×SDS-PAGE上样液的体积如下:
低分子量标准(BTN70704A)需要200μL。
中分子量标准(BTN70704B)需要100μL。
2．低分子量标准(BTN70704A)沸水浴中加热5分钟，短暂离心后将溶液按每管10μL的体积分装到多个塑料离心管中，置-20℃长期保存。
中分子量标准(BTN70704B)待完全溶解后，直接按每管10μL的体积分装到多个塑料离心管中，置-20℃长期保存。
3．使用时每次取一管，低分子量标准(BTN70704A)室温放置直到液体融化后即可上样进行SDS-PAGE电泳。中分子量标准(BTN70704B)需要在使用前65℃保温5分钟，然后上样进行SDS-PAGE电泳。BTN70704A型推荐使用12%的分离胶、BTN70704B推荐使用8%的分离胶。
4．电泳后进行考马斯亮蓝G-250染色，染色后出现的带型见上表。

二、溶液型的使用
1．将溶液按每管一次电泳的用量分装到塑料离心管中冻存，每次只用一管，这样避免反复冻融。
2．使用时取一管室温放置直到液体融化。
3．沸水浴中加热3～5分钟后趁热上样并进行SDS-PAGE电泳。BTN70704A型推荐使用12%的分离胶、BTN70704B推荐使用8%的分离胶。
 电泳后进行考马斯亮蓝G-250染色，染色后SDS-PAGE胶上将可见6条蛋白带(对BTN70704A)或6条蛋白带(对BTN70704B)，但由于共价结合了染料分子，各预染蛋白的分子量均稍大于染色前的蛋白，所以如果不需要估算未知蛋白的分子量，一般以染色前的各蛋白质的分子量作为参考。如果需要估算未知蛋白的分子量，则必须使用非预染蛋白电泳标准系列产品(BTN70102)，以避免误差。

本系列产品所含成分及分子量分布

分子量范围		低分子量	高分子量
肌球蛋白重链	200kD		有
钙调素结合蛋白	130kD		有
兔磷酸化酶B	97.4kD	有	有
牛血清白蛋白	66.2kD	有	有
兔肌动蛋白	43kD	有	有
牛碳酸酐酶	31kD	有
人生长激素	22kD	有
大豆胰蛋白酶抑制剂A	20.1kD
鸡蛋清溶菌酶	14.4kD	有

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