Southern级动物DNAout
发布日期：2013-06-26 浏览次数 ：1298
Southern级动物DNAout
产品及特点 本产品用于从动物培养细胞，动物实体组织和抗凝血液（新鲜或冷冻）中提取高分子量的Southern级的基因组DNA。它具有下列特点：
1. 即开即用，本产品足够5次中量提取（即每次处理0.5g组织），50次微量提取（即每次处理50-100 mg组织），。
2. DNA纯净，OD260/280值在1.8左右；完整性好，长度在100-200 Kb，适用于Southern杂交、基因文库构建等对DNA长度要求较高的试验，也可用于PCR和酶切等实验。
3. 产量高，每克组织DNA产率为500 ug，5×107个培养细胞可以得到200 ug DNA，20 mL新鲜血液可以得到250 ug DNA。足够多次Southern杂交使用。
规格及成分 成份 编号 5次大纸盒包装
裂解液 12065 50 mL
蛋白酶K溶液（10mg/mL） 80911 0.5 mL
Tris饱和酚 3191 100 mL
氯仿：异戊醇混和液 100804 100 mL
TE缓冲液 80934 50 mL
使用手册 1份
运输及保存 常温运输，4℃保存(但蛋白酶K需要低温运输，-20℃保存)，有效期一年。
自备试剂 PBS、氯仿、75%乙醇、无水乙醇
使用方法 注意：任何时候都不能剧烈震荡、过度离心、或过度干燥DNA，否则将发生断裂、难溶解等现象。
1. 根据材料的不同按下面的方法处理细胞：
a) 贴壁细胞：用橡胶刮子刮下5×107个-5×108个贴壁细胞并转移到10-15 mL塑料离心管中，1500 g 4℃离心10分钟收集细胞，用10 mL自备的PBS洗涤细胞2次，后将细胞悬浮于PBS中使细胞的浓度为5×107个/mL。取1 mL加入10 mL裂解液，轻柔颠倒混匀后放37℃水浴一小时。
b) 悬浮细胞：1500 g 4℃离心10分钟收集5×107个-5×108个细胞，用10 mL自备的PBS洗涤细胞2次，后将细胞悬浮于PBS中使细胞的浓度为5×107个/mL。取1 mL加入10 mL裂解液，轻柔颠倒混匀后放37℃水浴一小时。
c) 实体组织：把0.5 g新鲜的组织样品（约5×108个细胞）迅速剪切成不超过1立方厘米的小块放液氮中冻存，取出后放预冷的研钵中加液氮研磨成粉，待液氮挥发后，把组织粉末转移到10 mL裂解液中，让细粉在液面缓慢扩散，然后摇晃使组织粉末浸入裂解液中，后将溶液转移到10-15 mL塑料离心管中，轻柔颠倒混匀后放37℃水浴一小时。注意：实体组织中肝脏和脾脏的DNase活性较高，其DNA易断裂，故不要选用这两种材料，而是选用肺脏、肌肉、肾脏等材料。
d) 新鲜血液：1500 g 4℃离心20 mL新鲜抗凝血液（使用ACD抗凝，约含2×107个有核细胞）15分钟，去掉血浆，用吸管小心吸出淡黄色的一层并转移到一个新的离心管中，再次离心并取淡黄色层，在淡黄色层中加3 mL裂解液，37℃水浴一小时。
e) 冷冻血液：室温水浴融化15 mL冷冻血液（使用ACD抗凝，约含1.5×107个有核细胞），加入一倍体积的自备PBS溶液稀释样品，3500 g 室温离心15分钟，去掉血浆，加入3 mL裂解液，轻柔颠倒混匀后放37℃水浴一小时。
2. 在裂解样品中加入100 uL蛋白酶K溶液，轻柔颠倒混匀后放50℃水浴3-13小时。期间需要每隔半小时轻柔颠倒数次混匀。
3. 加10 mL的Tris饱和酚，轻柔颠倒10分钟混匀（混合液将呈乳浊状）。不要剧烈震荡，否则DNA将断裂。
4. 5000 g室温离心15分钟，用粗吸管（直径不小于3 mm）将粘稠的上清（含DNA）转移到新离心管中。可以将蓝抢头剪断一截用来转移上清，下同。也可以将下层有机相吸走。
5. 在上清中加入10 mL 酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混和液，颠倒5分钟混匀，5000 g室温离心5分钟，用粗吸管（直径不小于3 mm）将粘稠的上清（含DNA）转移到新离心管中。
6. 在上清中加入0.1倍体积的3M乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，轻柔颠倒混匀数次即可见絮状的DNA沉淀出现。在DNA还没变成白色（表示有SDS等沉淀附集在DNA上）前用玻璃棒或枪头将DNA挑出。
7. 将DNA浸入6 mL 75%乙醇中30秒，再浸入6 mL 无水乙醇中30秒。
8. 用枪头将DNA从玻璃棒上挂到一个干净的10mL或15mL塑料离心管中，室温放置30-60分钟让乙醇挥发，然后加入5-10 TE缓冲液，在DNA沉淀中加入1mL TE，65℃加热10分钟以促进DNA溶解和灭活残留的DNase，然后4℃放置过夜以让DNA彻底溶解。如果过夜溶解后DNA溶液浑浊，可以850g离心5分钟，取上清（DNA溶液）。
9. 取1-2uL在0.7%琼脂糖胶上电泳以检查DNA的完整性和浓度（需要用浓度确定的lambda DNA/HindIII作为电泳Marker），否则不能用于后续的酶切。也可测OD260和OD280计算产率，但此法不是非常准确。
10. 将DNA稀释到0.1ug/uL后可立即使用，也可以在4℃放置几周，但不建议在-20℃或更低的温度放置（DNA会断裂）。长期保存溶入乙醇中后放-20℃保存。
三：Southern级DNA的酶切（本试剂盒不提供所需试剂。在酶切高浓度DNA时，酶能否进入DNA内部非常关键，所以请严格按下面步骤操作）
11. 计算DNA酶切量与拷贝数。1 pg DNA=978 Million bp=0.978Billion bp。人基因组为3Bbp，Southern杂交至少需要10ug。
12. 设置200 uL的酶切反应：加入10 ug DNA，10 uL 10×酶切缓冲液，加水到190 uL，轻柔混匀后4℃放数小时让DNA松涨，期间混匀几次。
13. 按5U/ug DNA的比例加入所选择的内切酶，先在4℃混匀数分钟，再放到37℃酶切30分钟。此步有利于酶打开DNA。
14. 按5U/ug DNA的比例再加入所选择的内切酶，混匀后37℃ 8-12小时（为避免水分蒸发，加100uL石蜡油或在带热盖的PCR仪中进行）。
15. 取2uL酶切物电泳检测是否酶切完全，如果酶切不完全则需要分析原因。
16. 加20 uL 3M乙酸钠（pH5.2）和400 uL无水乙醇，混匀后离心10分钟沉淀DNA，再用1mL 75%乙醇洗涤一次，干甩数秒后吸干上清。
17. 立即加入50 uL TE过夜溶解DNA沉淀。
18. 56℃加热2-3分以打断DNA片段黏性末端间的结合，加上样液后全部上样到不含EB的、0.7%的琼脂糖胶上，按小于1V/cm的电压电泳12小时，结束后EB染色拍照后用于转膜。注意：需加1ng阳性质粒或标记的lambda/Hind III。如果不立即电泳，可存放于4℃数周。
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