一站式柱式miRNAout
发布日期：2013-06-25 浏览次数 ：931
一站式柱式miRNAout
产品及特点 本产品是在天泽基因miRNAout (CAT#:70501)基础上开发的柱式升级产品，是目前外市场上快速简单的小RNA分离纯化产品。它具有下列特点：
1. 一步法直接分离纯化小RNA，比两步法（先分离总RNA和再纯化其中的小RNA）和PAGE电泳回收法更简单。得到的小RNA长度大部分在200 nt以下，包括5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、pri-miRNA、siRNA、shRNA和snRNA等。
2. 柱式操作，比miRNAout更加简单快捷，整个过程只需要十多分钟。
3. 适用范围广，可以用于动物组织、血液、植物等各种实验材料。
4. 小RNA纯净，OD260/280一般都在1.9以上。
5. 产率一般为20-40 ug/100 mg动物组织，10-30 ug/100 mg植物组织。
6. 无基因组DNA的污染。
7. 可用于RT-PCR、miRNA标记、microarray等后续实验。
规格及成分 成 份 50次包装
溶液A 25 mL
溶液B 25 mL
溶液C 50 mL
离心吸附柱 100套
通用洗柱液 50 mL
RNA洗脱液 10 mL
使用手册 1份
运输及保存 常温运输，4℃保存，有效期一年。
自备试剂 氯仿。
使用方法 由于离心吸附柱的吸附量限制，本产品每次提取只能处理100mg左右的各种组织，可以在1.5 mL塑料离心管中。如果处理样品量大，请分成很多相当于微量提取的量进行，后再收集在一起。
1. 新鲜配制裂解液。将溶液A和溶液B按1:1的比例混合，然后根据组织细胞类型的不同分为下面及种情况使用。注意：溶液A和溶液B混合后必须立即使用，不要放置，否则会产生沉淀。
a) 对贴壁细胞：吸尽培养液，在每10平方厘米细胞中加入1 mL新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。
b) 对悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，在每1-5×106悬浮细胞中加入1 mL新鲜配制的裂解液，用枪轻柔吹打数次，确保细胞全部裂解。如果是fibroblasts或carcinoma cell，1 mL新鲜配制的裂解液的细胞使用量不要超过1×106个细胞。
c) 对新鲜的动物组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10 mL或15 mL塑料离心管中，每50-100 mg组织加1 mL新鲜配制的裂解液，用匀浆器匀浆30秒左右。对肝、脾、胰、肾等细胞分裂十分旺盛的组织（细胞中含大量正在复制的DNA），建议组织的使用量不要超过50 mg/ mL裂解液，否则十分容易产生DNA污染。
d) 对新鲜的植物组织：先将剪切成小块新鲜组织或液氮保存的组织放入10 mL或15 mL塑料离心管中，每50-100 mg组织加1 mL新鲜配制的裂解液，用匀浆器匀浆30秒左右。
e) 对RNALOCKER保存动物或植物组织：先用纸吸去RNALOCKER液体后再剪切成小块，放入10 mL或15 mL塑料离心管中，每50-100 mg组织加1 mL新鲜配制的裂解液，用匀浆器匀浆30秒左右。
2. 将裂解物转移至一个干净的1.5 mL塑料离心管中，然后加入0.2倍体积的自备氯仿(1 mL裂解物需0.2 ml氯仿)，振荡器上充分振荡混均30秒。
3. 12000-15000 g室温离心3-5分钟。
4. 将上清液（约0.6-0.8 mL）转移到一根离心吸附柱中以去除大RNA（标记以跟后面要用的专门吸附小RNA的另一离心吸附柱区别开来，本试剂盒提供的离心吸附柱之间没任何区别，可以随机选一个做大RNA吸附，另一个做小RNA吸附）。注意：离心后下层有机相和中间层含有DNA和蛋白质，避免触及，否则将产生蛋白质和DNA污染。为保险起见，可以留下100 uL上清液不取。同时吸取上清时缓慢进行，否则容易吸出交界面的不可见的丝状DNA。
5. 12000-15000 g室温离心半分钟，收集管中的穿透液。大RNA及DNA将与离心吸附柱的膜结合，小RNA将存在于穿透液中。但由于离心吸附柱的zui大吸附能力为40 ug动物RNA，20 ug植物RNA，如果样品中的大RNA含量高于上面数值，则穿透液中将同时含有大RNA和小RNA，在此情况下，穿透液需要再次重复上柱以去除大RNA。由于此时离心吸附柱已经吸附了大RNA，所以需要预处理（具体步骤见本手册后的附录）。
6. 在后得到的不含大RNA的穿透液中加等体积的溶液C，混匀。此时溶液的总体积约1.5 mL。
7. 先转移约0.75mL到一新的离心吸附柱中。注意：不要使用已经使用过的、用来吸附大RNA的离心吸附柱。12000-15000 g室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
8. 将上步上柱剩余的样品转移到离心吸附柱中，12000-15000 g室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
9. 加0.7mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12000-15000 g室温离心半分钟，弃穿透液。
10. 加0.3mL通用洗柱液到离心吸附柱中，12000-15000 g室温离心半分钟，弃穿透液。此步一般可以省略。
11. 12000-15000 g室温离心半分钟以甩出残联液体。此步十分重要，否则残留的通用洗柱液会影响miRNA的使用。
12. 将离心吸附柱转移到一自备的RNase-free收集管中，加入50-100 uL RNA洗脱液。
13. 12000-15000 g室温离心半分钟，离心管中溶液即为miRNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。
附录：
1. 将结合有大RNA和DNA的离心吸附柱中加入0.1mL自备的超纯水, 12000-15000 g室温离心半分钟，弃收集液。
2. 再加0.1mL自备的超纯水，重复上步一次。
3. 将第5步的得到、需要进一步去除其中大RNA和DNA污染的穿透液直接上柱，12000-15000 g室温离心半分钟，收集穿透液（此穿透液含小RNA）。
4. 如果大RNA已经去干净，可以直接进入第6步；如果大RNA没有去除干净，则用本附录1-2的方法处理离心吸附柱，然后再将此穿透液加入（接本附录第3步）。一般样品只需要额外处理一次就可以去除全部的大RNA污染。
推荐行情